HPLC-ESI-ITMS法分析蜜炙前后款冬花中毒性成分克氏千里光堿的變化

吳 笛， 雷 昌， 唐 林

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南長沙410208）

吡咯里西啶生物堿 （pyrrolizidine alkaloids）是一類由植物合成的天然有機化合物。迄今已發現400多個不同結構的吡咯里西啶生物堿，存在于世界各地6 000多種有花植物中，這些植物多集中于菊科、紫草科、豆科、蘭科。在已發現的吡咯里西啶生物堿中，約半數對人類和動物有毒，其毒性作用主要表現為肝臟毒性、肺臟毒性、基因毒性、致癌作用、神經毒性。因服用含吡咯里西啶生物堿的草藥、補劑、茶，或間接的食物污染 ［如蜂蜜、牛奶或肉類 （因動物攝取含吡咯里西啶生物堿的花蜜、牧草而蓄積毒性）等］導致人畜中毒的事件在許多國家均有報道［1］。

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，為常用中藥材，具有潤肺下氣、止咳化痰之功效。款冬含有微量的吡咯里西啶生物堿，1976年以來從中陸續檢測或分離得到幾種毒性和非毒性的吡咯里西啶生物堿［2-5］，其中克氏千里光堿是一種典型的毒性吡咯里西啶生物堿，是款冬中最主要的該類成分［5］。本課題組曾針對款冬花中的吡咯里西啶生物堿進行植化分離，成功分離得到克氏千里光堿，但沒有分離得到其他吡咯里西啶生物堿［6］。中醫認為，炮制可增強藥物的效用、減輕或消除藥物的毒性或副作用，款冬花臨床多用蜜炙品 （蜜款冬花），但蜜炙對其是否具有減毒作用目前尚無定論。

基于上述原因，本課題組認為有必要針對款冬花中的毒性吡咯里西啶生物堿開發一種簡便、準確的定量分析方法，通過比較蜜炙前后款冬花中毒性吡咯里西啶生物堿的含有量，分析蜜炙對其是否具有減毒作用。針對款冬 （包括花蕾、花、葉）中吡咯里西啶生物堿定量分析的不足之處在于，采用雜質干擾大、準確度低的比色法檢測總生物堿的含有量，結果準確性存疑［7-8］；或所建立的定量分析方法靈敏度不高，樣品處理方法復雜，不利于操作［9-12］。

基于款冬花中吡咯里西啶生物堿的低含有量 （約為0.015%）［2］及液質聯用 （LC-MS） 技術的高靈敏度，本研究擬采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用 （HPLC-ESI-ITMS）技術，針對款冬花中的微量毒性成分克氏千里光堿建立一種簡便快速、準確靈敏的含有量測定方法，考察蜜炙前后其變化，分析蜜炙對款冬花是否具有減毒作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Surveyor LC系統、LCQ DECA XPplus質譜儀（包括電噴霧離子源和離子阱質量分析器）、儀器控制和數據采集處理軟件 （Xcalibur1.3工作站） （美國 Thermo Finnigan公司）；TSKgel ODS-100S柱 （250 mm ×2.0 mm，5 μm，日本Tosoh公司）；KQ-500B型醫用數控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；AE200型分析天平 （萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；BP211D型分析天平（十萬分之一）、PB-10型酸度計 （德國Sartorius公司）。

1.2 材料 款冬花采集于國內各主要產區，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院吳笛鑒定為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。蜜款冬花的制備按照2015年版《中國藥典》一部款冬花項下相關要求及四部規定的蜜炙法進行［13-14］。藥材和蜜炙品在60℃下干燥后，粉碎成細粉（過3號篩）。

克氏千里光堿對照品為自制，結構經NMR和MS鑒定，純度經HPLC、LC-MS檢測其含有量大于98%；乙腈為色譜純，購于美國Fisher公司；96%甲酸為色譜純，購于美國Tedia公司；其他試劑均為分析純；水為純凈水，購于杭州娃哈哈集團有限公司。

2 方法與結果

2.1 分析條件 TSKgel ODS-100S柱 （250 mm×2.0 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.2%甲酸 （18∶82）； 體積流量0.2 mL／min； 柱溫 25℃； 進樣量 2 μL； 電噴霧離子化（ESI）；正離子模式；霧化氣 （氮氣）壓力220.64 kPa；輔助氣 （氮氣）壓力68.95 kPa；噴霧電壓5 kV；毛細管溫度300℃；毛細管電壓9 V；選擇克氏千里光堿的2個二級離子m／z 168、150作為定量分析離子。

2.2 對照品溶液制備 取克氏千里光堿對照品適量，精密稱定，加0.1%鹽酸制成每1 mL含100 μg該成分的溶液，作 為 貯 備 液， 分 別 稀 釋 至 200、 100、 50、 10、 1、0.5 ng／mL， 即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末0.5 g，精密稱定，加入50 mL 0.1%鹽酸超聲15 min，取出，0.1%鹽酸補足減失的質量，過濾，取續濾液，0.1%鹽酸稀釋10倍，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關系考察、最低檢測限 （LOD）和最低定量限（LOQ） 取 “2.2”項下貯備液，分別稀釋至1 000、500、200、 100、 50、 10、 1、 0.5 ng／mL， 在 “2.1” 項條件下進行分析。以對照品質量濃度為橫坐標 （X），相應的峰面積為縱坐標 （Y）進行回歸，逐步稀釋對照品溶液，按信噪比3和10分別計算LOD和LOQ，得回歸方程Y＝354 278X＋868 320 （R2＝0.997 2）， 在 0.5～200 ng／mL 范圍內線性關系良好， LOD 為100 pg／mL， LOQ 為500 pg／mL。

2.5 精密度試驗

2.5.1 日內精密度 每3 h 1次，取10、100、200 ng／mL對照品溶液在 “2.1”項條件下連續進樣5次，測得峰面積的RSD分別為1.96%、1.65%、0.91%，表明儀器日內精密度良好。

2.5.2 日間精密度 1次／d， 取10、 100、 200 ng／mL對照品溶液在 “2.1”項條件下連續進樣5 d，測得峰面積的RSD分別為2.08%、2.43%、1.99%，表明儀器日間精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一樣品6份，每份0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項條件下進樣，測得克氏千里光堿含有量RSD為2.31%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取 “2.6”項下同一供試品，在 “2.1”項條件下于0、6、12、24、48 h連續進樣5次，測得克氏千里光堿峰面積RSD為2.08%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取含有量已知的同一批樣品0.25 g，精密稱定，精密加入高、中、低3個劑量的克氏千里光堿對照品，共9份，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項條件下進樣，結果見表1。

表1 克氏千里光堿加樣回收率試驗結果 （n＝9）

2.9 樣品含有量測定 取藥材和蜜炙品 （蜜炙品取樣量折算成對應藥材量），按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項條件下進樣，計算含有量，結果見表2。

表2 克氏千里光堿含有量測定結果 （μg／g，±s， n＝3）

表2 克氏千里光堿含有量測定結果 （μg／g，±s， n＝3）

注：a為樣品1的蜜炙品，b為樣品4的蜜炙品，c為樣品7的蜜炙品

編號 來源 采集時間 含有量1 河北蔚縣 2016-12 88.35±0.62 2a — — 57.60±1.28 3a — — 59.11±0.80 4 山西廣靈 2016-12 67.52±0.95 5b — — 56.04±2.36 6b — — 53.66±1.77 7 甘肅隴西 2017-01 102.33±1.84 8c — — 80.27±0.24 9c — — 78.56±1.73 10 甘肅渭源 2017-01 93.02±2.26 11 甘肅靈臺 2017-01 77.43±0.83 12 山西沁源 2017-02 70.55±0.95 13 重慶巫溪 2017-04 52.66±2.73 14 河南洛陽 2017-11 45.38±1.90

3 討論

3.1 流動相優化 酸性流動相條件下生物堿在質譜儀中更易離子化，一般生物堿的檢測均選擇正離子模式。考察了酸性流動相條件下不同pH對克氏千里光堿色譜行為的影響，結果表明流動相pH越低，克氏千里光堿峰形越好，隨著pH升高，拖尾現象逐漸嚴重；3個pH （2.5、3.0、3.5）中，pH2.5時峰形最好，pH3.5時拖尾嚴重。同時考察了乙腈-甲酸水、甲醇-甲酸水系統對克代千里光堿色譜行為的影響，結果表明前者較后者分離效果更好，峰形更銳。經比較，選擇乙腈-0.2%甲酸 （pH 2.5）作為流動相。3.2 定量分析離子選擇 克氏千里光堿的二級質譜顯示有3個特征碎片離子，即m／z 168、150、122，見圖1。為提高檢測靈敏度，同時選擇豐度較高的二級離子m／z 168、150作為定量分析離子。

圖1 樣品分析圖譜

3.3 提取程序優化 重點考察了不同溶劑、提取方法對克氏千里光堿提取效率的影響?？紤]到指標成分為生物堿，在考察提取溶劑時選擇了不同濃度的酸性溶液，結果表明，以50 mL 0.1%鹽酸為溶劑超聲15 min時，提取效率較高。

3.4 雜質峰 款冬花供試品溶液的選擇離子色譜圖及二級離子色譜圖 （圖1）均顯示有一較小雜質峰，表明尚含有克氏千里光堿的同分異構體，且具有相同的特征碎片離子m／z 168、150，但含有量遠低于克氏千里光堿。文獻［5］報道款冬含有新克氏千里光堿，為克氏千里光堿的同分異構體 （僅C15、C20間雙鍵構型不同，克氏千里光堿為Z構型，新克氏千里光堿為E構型），推測此雜質峰即為新克氏千里光堿。因缺乏新克氏千里光堿的對照品，此雜質峰的歸屬有待進一步確證。

3.5 克氏千里光堿線性范圍 克氏千里光堿在0.5～200 ng／mL的質量濃度范圍內線性關系較好，質量濃度高于500 ng／mL時變差，即質量濃度越高線性關系越差，具體原因有待深入探討。因此，在制備供試品溶液時，提取液過濾后取續濾液，用0.1%鹽酸稀釋10倍，以供LC-MS進樣分析。

3.6 克氏千里光堿含有量測定 不同產地款冬花中克氏千里光堿含有量差別較大，這可能與其不同的生長環境有關；蜜炙品中克氏千里光堿含有量均顯著低于對應藥材，表明蜜炙可一定程度上降低其含有量，這可能是在蜜炙的高溫炒制過程中該成分部分分解或發生其他化學反應所致，表明蜜炙對款冬花可能具有一定的減毒作用，具體原因有待深入研究。

2015年版 《中國藥典》一部收載了數種含有毒性吡咯里西啶生物堿的藥材，如千里光、野馬追、款冬花、紫草，并涉及數十種成方制劑，且大多數品種缺乏對此類成分的安全限量規定，其潛在的用藥風險可能被忽視?；趯χ兴幇踩詥栴}的重視及降低可能藥物不良反應和用藥風險的考慮，有必要開展相關基礎研究，進行毒性評價，并在此基礎上對含有毒性吡咯里西啶生物堿的中藥加強質量控制，設定安全限量。本實驗采用HPLC-ESI-ITMS技術針對款冬花中主要毒性成分克氏千里光堿建立了定量分析方法，該方法簡便快速、準確靈敏，可為該藥材質量標準的完善提供參考。