益生菌復合發酵酸奶的工藝優化及其抗氧化性研究

秦楠，金婕妤，張芹仙，杜嬌

（山西中醫藥大學制藥與食品工程學院，太原030619）

0引 言

酸奶作為發酵型乳制品，不僅可以促進腸道消化、降低膽固醇，還可改善乳制品的風味和質地[1-2]。益生菌酸奶在改善人體腸道菌群分布和乳糖的代謝方面發揮著重要作用[3]。

北芪菇是平菇添加黃芪培育而成的一種新型食用菌，其營養價值更高，尤其硒含量較普通平菇提高15%[4]。具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、改善和預防心腦血管疾病、調節免疫，有助于胃腸運動、促進消化等藥理作用[5-6]。紅棗不僅含有豐富的營養成分，還富含多種生理活性物質，如紅棗多糖、有機酸及黃酮類等物質，具有抗疲勞、安神益氣、抗氧化多種保健功能[7]。

本研究以益生菌與傳統乳酸菌合理配比復合發酵制備北芪菇紅棗酸奶，并研究了其體外抗氧化活性，為工業化生產提供理論依據和實踐指導。

1 實驗

1.1 材料與儀器

益生菌為雙歧桿菌(Bifidobacterium)；發酵菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusbulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。

培養基：MRS培養基，MC培養基，結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養基。

原料：北芪菇，北芪菇，市售紅棗，純牛奶，蔗糖（市售）。

儀器：榨汁機（BL25B36），HH-4數顯恒溫水浴鍋，消解爐（SPT20），自動定氮儀（SPD60），電熱鼓風干燥箱（GZX-9140MBE），電熱恒溫培養箱（HPX-9082MBE），高壓滅菌鍋（DY04-13-44-00），PH計（PHS-3C）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

（1）紅棗汁的制備工藝。

選料→清洗→浸泡紅棗（60℃，3 h）→去核→煮制（料液比1∶3、70℃，20 min）→打漿→殺菌（121℃，20 min）→過濾→冷卻→備用

（2）北芪菇紅棗酸奶生產工藝流程。

純牛奶→紅棗汁、北芪菇粉→混合→過濾→標準化（加蔗糖）→均質（20 MPa，5 min）→殺菌→冷卻→接種→罐裝→發酵→后熟(4℃)→成品

1.2.2 單因素實驗

改變單一因素，固定其他條件，分別考察北芪菇添加量、北芪菇與紅棗汁比、蔗糖添加量、菌種復配比（益生菌：發酵菌種(德氏乳桿菌保加利亞∶嗜熱鏈球菌=1∶1）、接種量、發酵時間與發酵溫度，感官評分為評價指標，利用單因素實驗確定各因素的最適范圍。不同因子梯度條件如表1所示。

表1 單因素水平設計

1.2.3 響應面實驗

基于單因素實驗結果，選用中心組合實驗Box-Behnken設計方案，選取北芪菇與紅棗汁比、蔗糖添加量、接種量3個變量，以A，B，C來表示，并以+1，0，-1分別代表其變量的水平；按方程x=(X-X0)/△X對自變量進行編碼，其中：x為變量的編碼值；X為變量的真實值；X0為實驗中心點變量的真實值；△X為變量的步長變化。感官評分Y表示響應值，如表2所示。

表2 響應面實驗因素水平編碼 %

1.2.4 檢驗方法

（1）感官評價。感官評價小組共10人，年齡在18-25歲之間，均接受過《食品感官分析》課程培訓。根據表3感官評分標準對益生菌復合發酵北芪菇紅棗酸奶進行感官評價。

（2）抗氧化活性的測定。將益生菌酸奶進行不同質量濃度梯度稀釋，采用DPPH法和ABTS+法，分別測定其抗氧化活性[8-10]。

（3）活菌數的測定。益生菌酸奶采用生理鹽水進行梯度稀釋，用各種選擇培養基平板傾注法，測定乳酸菌和雙歧桿菌的活菌總數[11]。參考GB 4789.35-2010乳酸菌菌落數的測定方法[12]。

（4）滴定酸度的測定。參考GB5413-34-2010所述方法對發酵乳滴定酸度進行測定[13]。

（5）蛋白質質量分數測定采用凱式定氮法[14]。

表3 益生菌復合發酵北芪菇紅棗酸奶感官評分標準

1.3 數據分析

本研究所有的試驗數據均使用Origin和Design-Expert(version8.0.6)統計軟件進行數據處理，運用最小差異顯著法（LSD）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 北芪菇添加量對酸奶感官評分的影響

如圖1所示，隨北芪菇添加量逐漸增大感官評分呈先升后降的趨勢，酸奶組織狀態無差異，當添加量為0.20 g時，酸奶北芪菇味適中且口感細膩，當添加量為0.25 g時，北芪菇的味道過重，且口感較粗糙。故選擇北芪菇添加量為0.20 g。

圖1 北芪菇添加量對酸奶感官評分的影響

2.1.2 北芪菇與紅棗汁比對酸奶感官評分的影響

如圖2所示，感官評分隨著北芪菇與紅棗汁比的升高先升后降，對酸奶口感影響較大。在比例為1∶25～1∶75之間，紅棗和北芪菇復合味道較淡，黏稠性較好；當比例為1∶100時，復合味道適中，酸奶風味濃郁，黏稠性好，口感細膩，無乳清析出；1∶125時，紅棗的味道過重，完全掩蓋了北芪菇的味道，故選擇北芪菇與紅棗的配比為1∶100(質量體積比)。

2.1.3 蔗糖添加量對酸奶感官評分的影響

圖2 北芪菇與紅棗的配比對酸奶感官評分的影響

如圖3所示，感官評分隨著蔗糖添加量的增加呈現先升高再下降的趨勢，影響顯著。當添加量為3%時，酸奶口味略偏酸，但有淡淡的紅棗味，口感較細膩；4%時，酸甜適口，有濃郁的酸奶味，并呈現出獨特的北芪菇紅棗復合風味，口感細膩，黏稠性好；當蔗糖添加量為5%～7%時，口感略甜，隨糖量增加，逐漸掩蓋了紅棗的風味[15]。故選擇蔗糖添加量為4%。

圖3 蔗糖添加量對酸奶感官評分的影響

2.1.4 菌種復配比對產品品質的影響

如圖4所示，感官評分隨著益生菌與傳統發酵菌種的比例變化呈現先升后降的趨勢，比例為1∶3時，酸奶口感細膩，酸甜適口，黏稠性好；比例繼續增大，酸味提高，對產品風味有較大影響，故先擇菌種復配比1∶3。

圖4 菌種復配比對酸奶感官評分的影響

2.1.5 接種量對酸奶感官評分的影響

如圖5所示，隨著復合菌種（益生菌：發酵菌種=1:3）接種量的增大，感官評分呈先上升后下降的趨勢，影響顯著。當接種量為0.02%～0.06%時，酸奶較為稀薄，口感略甜，可能是接種量少，發酵產酸不夠所致；當接種量為0.10%時，有濃厚的酸奶風味，口感細膩柔和，黏稠性好，無乳清析出；當接種量為0.14%～0.18%時，有乳清析出，口感偏酸，黏稠度高。故選擇接種量為0.10%。

2.1.6 發酵時間對酸奶感官評分的影響

圖5 接種量對酸奶感官評分的影響

如圖6所示，感官評分隨著發酵時間的延長先上升再下降，當發酵時間為5 h時，酸奶酸甜適口，黏稠性好，口感細膩，柔和，感官評分達90分；故選擇發酵時間為5 h。

圖6 發酵時間對酸奶感官評分的影響

2.1.7 發酵溫度對酸奶感官評分的影響

如圖7所示，隨著發酵溫度的升高感官評分呈先長后降的趨勢，當發酵溫度為42℃時，酸奶酸甜可口，口感細膩，黏稠性好；溫度過低會造成乳酸菌發酵不夠，酸奶過甜，稀薄；溫度過高則導致酸奶有少量的乳清析出，風味有些偏酸[16-17]。故選擇發酵溫度為42℃。

圖7 發酵溫度對酸奶感官評分的影響

2.2 響應面實驗結果

（1）響應面實驗設計與結果如表4所示。

（2）模型的建立及其顯著性檢驗。利用Design-Expert(version8.0.6)軟件對表3中實驗數據通過多元回歸擬合，得到益生菌復合發酵北芪菇紅棗酸奶的感官評分（Y）對自變量北芪菇與紅棗的配比（A）、蔗糖添加量（B）、接種量（C）的回歸方程為

Y=89.40-3.37A+3.75B-0.88C-1.00AB-4.25AC-2.00BC-11.58A2-6.83B2-4.57C2。

由表4可知，實驗模型的P＜0.0001，說明此模型極顯著，模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，此模型失擬項P=0.5413＞0.05，表明模型不顯著，擬合的概率高，運用到試驗中誤差小。該模型的相關系數R2=0.9888，且模型的調整確定系數R2Adj=0.9964，說明此模型能用于99.64%的實驗結果解釋，僅只有0.36%的試驗結果不能用此模型解釋，進一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

表4 Box-Behnken實驗設計及結果

表5 回歸模型方差分析

由表5中的F值的大小可以判斷各因素對益生菌復合菌發酵北芪菇紅棗酸奶質量影響的強弱，F值越大，說明該因素對于感官評價的影響程度越大。故根據上表可得出各因素對于北芪菇紅棗酸奶感官評價的影響程度大小依次為蔗糖添加量（B）＞北芪菇與紅棗汁比（A）＞接種量（C）。

根據上述回歸方程繪制出響應面圖，以確認北芪菇與紅棗汁比、蔗糖添加量、接種量3個因素對益生菌酸奶質量的影響，如圖8所示。

由圖8可以看出，響應值隨著北芪菇與紅棗的配比、蔗糖添加量與接種量的增加均呈現先增大后減小的變化趨勢，3個影響因素均存在一定的交互作用。從方差分析中可知，交互作用均極顯著。各圖中兩個因素曲面坡度相似，說明在固定實驗水平范圍之內，兩個因素對感官評分的變化影響相近。

2.3 驗證實驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得，最佳的制備工藝條件為北芪菇與紅棗汁比為1∶86（g/mL），蔗糖添加量為4.30%，接種量為0.10%，在此條件下的感官評價得分為90.2407分。考慮實際操作的方便性，將最適參數修正為：北芪菇與紅棗的配比為1∶100（質量體積比），蔗糖添加量為4%，接種量為0.10%，為了驗證模型預測的準確性，重復試驗3次，所得平均值與理論預測值非常接近，且相對誤差小于2%，說明重復性良好。

2.4 抗氧化活性的測定

以維生素C作為對照，分別測定益生菌酸奶對DPPH、ABTS+自由基的清除效果，二者都表現出有很好的清除能力，而且與酸奶濃度成正比。這可能是由于添加北芪菇、紅棗后，酸奶中增加了多糖、酚類、蛋白質等生物活性物質，進而提高了樣品的抗氧化能力[18]。其中，對比兩種自由基清除能力發現，清除DPPH自由基的能力較ABTS+自由基高。

圖8 各因素交叉作用對益生菌酸奶的感官評分影響的響應面和等高線

2.5 儲藏期內益生菌酸奶活菌數的變化

由圖9可知，益生菌酸奶中活菌總數隨著儲藏時間的延長，在10～16 d期間菌數增長量大、增速快；隨著儲藏時間延長菌數逐漸下降，這可能是由于活菌產生的代謝產物增多，造成的酸性環境對其菌體本身產生抑制，同時導致菌體進入老化、衰亡期[19]。

圖9 儲藏間內發酵乳活菌數的變化

2.6 產品質量評價

（1）感官指標。色澤：色澤均勻一致，乳黃色。組織狀態：細膩、均勻，允許有少量乳清析出。滋味：酸甜適口，口感絲滑，酸奶香氣濃郁，有爽口的紅棗味和淡淡的北芪菇味，無異味。

（2）理化指標。蛋白質為4.3%，酸度為74.2°T，p H值為4.5。均符合發酵乳GB19302-2010相關規定。

（3）微生物指標。乳酸菌總數為4.4×107mL-1；菌落總數＜100 mL-1；大腸菌群數、致病菌未檢出。

3 結 論

試驗對北芪菇紅棗酸奶的口感、酸度、活菌數進行了測評，通過單因素與響應面設計與分析，探索了益生菌雙歧桿菌與傳統乳酸菌(德氏乳桿菌保加利亞亞和嗜熱鏈球菌)復合發酵北芪菇紅棗酸奶的工藝條件。最佳條件為：北芪菇添加量為0.2 g，北芪菇與紅棗汁的配比為1∶100(質量體積比)，益生菌與發酵菌比例1∶3，接種量0.1%，蔗糖添加量為4%，發酵溫度為42℃，發酵時間為5 h。按此配方研制的益生菌酸奶蛋白質含量為4.38 g/100 g，酸度為74.2°T，乳酸菌總數為4.4×107mL-1，p H值為 4.5，口感細膩，色澤均勻。在儲藏期內活菌數表現出良好的穩定性，優于傳統乳酸菌菌種發酵的同類產品。經添加北芪菇、紅棗汁制備的新型復合酸奶對DPPH和ABTS+均有較強的抗氧化性，且對DPPH自由基的清除能力更強，是一款風味獨特、營養保健型的復合酸奶。