一株甘藍內生枯草芽孢桿菌16S rDNA序列的克隆與分析

蔣 明，朱 欣，楊如棉，鄔張穎，應夢豪，馬佳瑩，王佳怡，張慧娟

(臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000)

芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌隸屬于芽孢桿菌科，廣泛分布于自然界，種類十分豐富，在《芽孢桿菌文獻研究》中記載了244種，并不斷有新種發現的報道[1-4]。常見的芽孢桿菌屬細菌包括巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformus)、堅強芽孢桿菌(B.firmus)、側孢芽孢桿菌(B.laterosporus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)等，在工業、農業、醫學、食品及環保等行業得到廣泛應用[5-8]。其中，枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓至圓柱狀，能還原硝酸鹽，是一種好氧細菌[5]。枯草芽孢桿菌的應用和研究已有100多年的歷史，在農業上，枯草芽孢桿菌常用作植物病害的生防菌[9]。枯草芽孢桿菌V26用于防治由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的馬鈴薯黑絲菌病，具有良好的生防效果[9]；枯草芽孢桿菌HK-CSM-1防治人參炭疽病(Colletotrichumpanacicol)具有很好的效果[10]。

細菌鑒定的方法有形態學、生理生化和分子鑒定等，形態學和生理生化反映細菌的表型性狀，易受外界環境及菌體生理狀態的影響，而分子鑒定則不受內外環境的干擾，鑒定結果更具科學性和重演性[11]。5S rDNA、23S rDNA和16S rDNA是細菌核糖體的3個編碼基因，其中，16S rDNA由于長度適中，兼有保守區和可變區，能提供足夠的多態性，目前已廣泛應用于細菌的分子鑒定和分類研究[12-15]。16S序列在枯草芽孢桿菌的鑒定上也有應用，LOTFY W A等[16]利用16S結合形態和生化鑒定，鑒定出一株產鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的枯草芽孢桿菌；SUBBA REDDY GANGIREDDYGARI等[17]從土壤中分離到一株可降解有機磷殺蟲劑喹硫磷的細菌，經測定16S DNA序列，鑒定為枯草芽孢桿菌。臺州學院生命科學學院實驗室前期從甘藍健康植株中分離到一株內生細菌GL06，經形態和生理生化鑒定，初步判斷為枯草芽孢桿菌，該菌對根腫菌有一定的防治效果。筆者以枯草芽孢桿菌GL06為材料，利用PCR法克隆16S序列，并比對分析，以期為后續研究該菌的功能和開展生產應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌GL06，為甘藍內生菌，該菌分離自甘藍健康植株的葉柄組織，經鑒定后保存于臺州學院生命科學學院實驗室，該菌革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，無莢膜，能產生柱狀芽孢；菌落表面粗糙，邊緣不規則。細菌基因組 DNA 提取試劑盒，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。DNA凝膠回收試劑盒，購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 用細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌GL06的DNA，操作根據其提供的說明書進行。DNA經電泳檢測后，置于-20℃保存。

1.2.2 16S rDNA序列的克隆 采用PCR法克隆枯草芽孢桿菌16S rDNA序列，上、下游引物分別為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(27F)和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(1492R)。PCR反應體系20 μL：10×PCR緩沖液2 μL，模板DNA 20 ng，dNTPs(10 mM)0.45 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，加ddH2O至終體積。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃ 變性30 s，55.5℃退火45 s，72℃延伸2 min，共32個循環；72℃最后延伸10 min。

1.2.3 PCR產物的回收、連接和轉化 PCR擴增結束后，產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。用潔凈的刀片割取含目的條帶的膠塊，置于1.5 mL無菌離心管中，用DNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段。取3 μL回收產物與2×Rapid Ligation Buffer 5 μL、pGEM-T Easy載體(Promega)1 μL和T4DNA連接酶1 μL混合，置于4℃連接過夜。用熱激法導入Trans5α感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)。經涂布平板，挑取白色單菌落于37℃振蕩培養12 h，經菌液PCR鑒定后，挑取3個陽性克隆用于測序。菌液PCR反應體系與程序同16S rDNA序列的克隆，模板DNA改為0.5 μL菌液。

1.2.4 16S rDNA序列比對分析 序列相似性比較在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數據庫進行，從NCBI數據庫下載10種芽孢桿菌屬細菌的16S序列，分別是凝結芽孢桿菌(B.coagulans)(KJ148634.1)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)(NR_043401.1)、細胞毒素芽孢桿菌(B.cytotoxicus)(NR_074914.1)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)(NR_041455.1)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)(NR_043403.1)、韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)(NR_024697.1)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)(NR_074540.1)、環狀桿菌(B.circulans)(EU733231.1)、簡單芽孢桿菌(B.simplex)(NR_042136.1)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(NR_112116.2)。去除兩段多余序列后用Mega軟件構建系統發育樹，建樹方法為鄰接法。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA序列的克隆

以27F和1492R為上、下游引物，從枯草芽孢桿菌GL06基因組DNA中擴增到16S序列。該片段的大小約1 500 bp，條帶清晰、單一，無明顯的雜帶(圖1)。經割膠、回收后，得到高純度的回收產物，用于與載體的連接。

注：M為DNA分子量標準；1～4為枯草芽孢桿菌GL06基因組16S rDNA的PCR產物。Note: M,DNA marker; 1-4,PCR products of 16S rDNA in genome of B. subtilis strain GL06.

2.2 序列比對

經測序，3個陽性克隆的16S rDNA序列完全一致，長度均為1 510 bp(圖2)。GL06 16S序列中A、T、C、G的比例分別是24%、22%、31%和23%，GC值為54%。該序列與NCBI數據庫中枯草芽孢桿菌(NR_112116.2)16S序列的相似性最高，達99%，僅存在3個堿基差異；與解淀粉芽孢桿菌(NR_041455.1)的相似性次之，達98%；與其余芽孢桿菌屬的相似性為93%～94%。

經多序列比對，GL06 16S與其他16S相比，序列上存在插入/缺失及轉換和顛換現象。與環狀桿菌16S相比，GL06 16S在46位存在插入現象；與巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和細胞毒素芽孢桿菌的16S相比，在47位存在1個堿基缺失；與巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和細胞毒素芽孢桿菌比較，GL06 16S在3位存在C?T轉換現象，在48位發現A?T顛換(圖3)。11條序列中，共有201個可變位點(Variable site)，其中，簡約性信息位點(Parsimony-informative site)135個，單態突變位點(Singleton variable site)66個。

注：單下劃線為上游引物27F，雙下劃線為引物1492R的反向互補序列。Note: Single underline,forward primer 27F; Double underline,reverse complement sequence of primer 1492R.

圖3 枯草芽孢桿菌GL06及其同源序列的多重比對Fig.3 Multiple comparison in 16S rDNA sequence between B. subtilis strain GL06 and its homologous sequences

2.3 系統發育樹

芽孢桿菌屬11個菌株總的遺傳距離為0.055，GL06與枯草芽孢桿菌的遺傳距離最小，僅0.001；與簡單芽孢桿菌的遺傳距離最大，為0.070。從圖4看出，11個菌株在系統發育樹上可分為4組，GL06與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌聚于組IV，支持率為100%；蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌處于同一分支，再與細胞毒素芽孢桿菌聚于組I，支持率為100%；環狀桿菌、簡單芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌聚于組Ⅱ；凝結芽孢桿菌單獨位于組Ⅲ。

3 結論與討論

目前，細菌的鑒定方主要有傳統的形態學觀察、血清型鑒定、毒力測試、生化測定、儀器自動化鑒定和分子鑒定等[18]。分子鑒定方法有GC含量測定、DNA-DNA分子雜交、指紋圖譜和16S序列分析等，此外，RNA 聚合酶的σ因子(rpoD)基因和促旋酶B亞基(gryase，gryB)基因在細菌分類和檢測中也有一定應用[19-20]。rpoD、gryB等持家基因具有較快的進化速率，不同物種間的序列差異顯著，而且分辨能力高，目前已應用于細菌的鑒定和系統發育研究[21-23]。盛強等[20]利用16S、gryB和rpoD等對辣椒(Capsicumannuum)一種新的細菌性葉斑病病原菌進行了鑒定，初步判定為黃褐假單胞菌(Pseudomonasfulva)；盧佳琦等[24]結合16S和gryB對一株從凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)活菌片中分離的細菌進行鑒定，該菌與標準菌株的序列相似性達100%，明確該菌株為蠟樣芽孢桿菌。

在分子鑒定方法中，對16S序列進行克隆、測序和比對，是目前鑒定細菌最為常用的方法。利用引物27F和1492R可擴增出約1 500 bp的片段，該序列具高度保守、中度保守和高度可變化的區域，可用來研究進化距離不同的細菌之間的關系和鑒定[25-26]。本研究利用通用引物從一株甘藍內生枯草芽孢桿菌中克隆到長度為1 510 bp的片段，其序列大小與NCBI數據庫中枯草芽孢桿菌(NR_112116.2)完全一致，但在序列組成上存在個別堿基的差異。BOSSHARD P P等[27]研究認為，相似率>99%可定義為種，結合前期的形態學和生化鑒定結果，確定GL06是枯草芽孢桿菌。陳美琪等[28]從健康鱸魚中分離出一株細菌，其16S rDNA基因序列與枯草芽孢桿菌的相似性達99%，因此確定該種為枯草芽孢桿菌。呂美云等[29]從豆豉中分離到5株產纖溶酶的細菌，通過測定16S序列，其中，有2株與枯草芽孢桿菌的相似性達99%，認定2株細菌為枯草芽孢桿菌。同屬細菌之間的16S序列通常十分接近，一般認為，16S rDNA相似性為95%～99%可確定為同屬，但GL06菌株除與枯草芽孢桿菌(NR_112116.2)和解淀粉芽孢桿菌(NR_041455.1)外，與其余8種芽孢桿菌屬菌株間的相似性低于這個范圍，與嚴婉榮等[30]的研究結果一致。

以甘藍內生菌枯草芽孢桿菌GL06為材料，利用通用引物進行PCR擴增，獲得該菌的16S rDNA。GL06菌株16S序列的GC含量為54%，與來自NCBI數據庫的枯草芽孢桿菌16S相似性高達99%，僅存在3個堿基的差異。芽孢桿菌屬11個菌株(GL06、凝結芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、細胞毒素芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、環狀桿菌、簡單芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌)在發育樹上可分為4組，其中，GL06與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌聚為一組。甘藍內生枯草芽孢桿菌GL06菌株16S rDNA的克隆與序列分析，為后續該菌的功能研究和生產應用奠定了基礎。