家蠶致病性白僵菌的分離鑒定及其在僵蠶人工飼養(yǎng)中的應用

李文學， 青學剛， 陳寶瑞， 肖文福， 鄒邦興， 劉俊鳳

(四川省農業(yè)科學院 蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000)

僵蠶為常用大宗藥材，來源于蠶蛾科昆蟲家蠶(Bombyxmori)4～5齡幼蟲感染(或人工接種)白僵菌(Beauveriabassiana)致死的干燥體[1]。主產于四川、江蘇、浙江、廣東及山東等省，以四川省產量最大，為川產藥材主流品種。其味咸、辛，性平；歸肝、肺、胃經；具有祛風定驚，化痰散結的功效；常用于驚風抽搐，咽喉腫痛，皮膚瘙癢；頜下淋巴結炎，面神經麻痹等病癥的治療[2]。《中國藥典》明確指出，僵蠶只能是由球孢白僵菌感染致死的才能入藥。基于白僵蠶擁有的獨特中藥藥效和巨大市場開發(fā)空間，國內眾多專家學者在白僵蠶人工培養(yǎng)方面開展了相關研究。王印安等[3-4]探索出“制種-接種-培養(yǎng)-采集”的技術方案，分析了不同濃度孢子懸浮液對家蠶感染率，濕度對分生孢子侵染蠶體的影響。李冬生等[5]通過研究湖北養(yǎng)蠶區(qū)僵蠶白僵菌的基本生物學特性，為分離純化培養(yǎng)白僵菌并人工接種到蠶蛹上，使之培養(yǎng)加工轉化為白僵蠶蛹提供了可行的技術支撐。路國兵等[6]對山東省主要蠶區(qū)白僵菌進行分離、培養(yǎng)、鑒定和基礎生物學特性研究，為白僵菌篩選技術方案的建立及人工生產提供了可靠的技術依據(jù)[6]。孫偉屹等[7]從自然感病僵蠶身上提取到5株白僵菌菌株，并對其基礎生物學特性及對家蠶的毒力進行研究。

近年來，隨著養(yǎng)蠶技術的提高，嚴格防控各類家蠶病蟲害發(fā)生，自然感病獲得的僵蠶數(shù)量日益減少，已不能滿足藥材市場對僵蠶的需求[8]。而市場上僵蠶質量魚目混珠，參差不齊，甚至以裹石灰、廣灰等手段冒充僵蠶，嚴重影響藥品質量安全[9]。目前，四川蠶區(qū)已開展白僵蠶專門人工養(yǎng)殖，在生產中使用的菌種多是感病死亡僵蠶孢子粉，未進行純化優(yōu)選，而且人工培養(yǎng)生產的方式簡單粗放，菌種施用濃度隨意性大，僵化死亡率得不到保證，僵蠶收益率普遍較低。在規(guī)模化人工飼養(yǎng)僵蠶生產中，球孢白僵菌的施用濃度是影響僵蠶收益率的關鍵因素。施用濃度過高，不僅增加菌種成本，而且造成僵蠶蠶體較小就集中死亡，影響收益[10]；施用濃度過低，白僵菌侵染家蠶后發(fā)病死亡時間較長，部分家蠶死亡時已形成繭殼，增加削繭取僵蛹的工作，難以收集，同樣影響收益。鑒于此，采用形態(tài)學觀察與分子生物學相結合的方法對從自然感病僵蠶上分離的致病菌株進行鑒定，并研究其人工飼養(yǎng)僵蠶的最適使用濃度，以期為僵蠶人工飼養(yǎng)提供優(yōu)良菌株并提高僵蠶的養(yǎng)殖效益。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蠶 僵蠶分離株為自然感病白僵蠶，來源于四川省南部縣興盛鄉(xiāng)蠶業(yè)合作社；人工飼養(yǎng)家蠶品種為“川山×蜀水”，由四川省農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所家蠶育種研究室提供。

1.1.2 試劑 PDA培養(yǎng)基，自制；70%乙醇、0.5%吐溫80、E.Z.N.A.TMFungal DNA Miniprep Kits試劑盒、引物ITS-F (5’-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3’)、引物ITS-R ( 5’-GGAAGTAAAAGT

CGTAACAAGG-3’)、模板DNA、10×PCR緩沖液、dNTP、5 U/μL Taq酶和滅菌水，市購。

1.1.3 儀器設備 OLYMPUS BX53+CCD DP73，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 白僵菌的分離純化 在無菌操作臺上用70%乙醇將自然感病死亡的白僵蠶表面消毒1 min，酒精燈火焰灼燒1 s后，再用無菌水沖洗2～3次，放置于無菌培養(yǎng)皿中，在25℃、空氣相對濕度(RH) 80%的無菌環(huán)境條件下培養(yǎng)，5 d后蠶體遍布白色菌絲。挑取少量菌絲體經PDA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，2 d后挑取單菌落再次擴大培養(yǎng)，供后續(xù)形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定及病原擴繁等使用。

1.2.2 分離菌株的鑒定

1) 形態(tài)學鑒定。將擴繁的單菌落菌株用0.5%吐溫80液配制成濃度為1×107個/mL的孢懸液，用接種針將孢懸液接種于 PDA 平板培養(yǎng)基，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7天觀察記錄菌株菌落形態(tài)特征，并在光學顯微鏡下觀察該菌株的產孢結構和分生孢子形態(tài)[11]。

2) 分子生物學鑒定。取50 mg分離菌株的孢子粉用E.Z.N.A.TMFungal DNA Miniprep Kits試劑盒提取基因組DNA，利用通用引物ITS-F和ITS-R進行rRNA基因ITS序列的PCR擴增。PCR反應體系25 μL，包括模板DNA 1 μL、10×PCR緩沖液 2.5 μL、dNTP 2 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL和17.5 μL滅菌水；擴增反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，54℃ 1 min，72℃ 30 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸 10 min。由上海生物工程股份有限公司測序。將菌株ITS序列擴增片段測序結果與NCBI 數(shù)據(jù)庫已登錄真菌ITS序列進行比對，下載部分菌株序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹；選用蠟蚧輪枝菌(Lecanicilliumlecanii) ICAL-7 的同源序列作為外群，500次重復[12-13]。

1.2.3 不同濃度分離菌株孢懸液對家蠶的致病力 用含0.5%吐溫80的無菌水將分離菌株孢子粉制備成1×108個/mL、5×107個/mL、1×107個/mL、1×106個/mL及5×105個/mL的孢懸液備用。試驗設5個處理，對5齡及以上蠶的體表分別均勻噴施上述5個濃度的孢懸液，以噴施清水為對照，每個處理噴施家蠶500頭，3次重復。噴施環(huán)境控制在(26±2)℃，RH≥80%。噴施接種白僵菌后逐日記錄發(fā)病死蠶數(shù)，將僵蠶及時揀出，充分僵化后經60℃烘干至恒重，調查各處理僵化死亡率及僵蠶平均單條重量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，并繪制僵化死亡率折線圖及僵蠶平均單條重量柱形圖。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學特征

從圖1可見，經25℃培養(yǎng)7 d后分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落正面呈白色絮狀，質地緊密，略隆起；背面呈淺褐色，無可溶性色素。無特化的分生孢子梗；產孢細胞燒瓶狀，簇生于菌絲頂端或其分枝上，直或彎曲，大小(6.1～35.8)μm×(1.5～2.2)μm，頸部細長，頂端“之”字形延伸，寬度不足1 μm；分生孢子寬橢圓形或近球形，無色，壁光滑，大小1.5～3.0 μm，未見有性態(tài)產孢結構。

注：A，PDA培養(yǎng)基上的菌落；B，菌株的產孢結構。Note: A,colonies cultured on PDA medium; B,conidiogenous structure of the strain.

2.2 分離菌株的ITS序列測定與系統(tǒng)發(fā)育進化

PCR擴增獲得分離菌株的 rRNA-ITS 序列長度為525 bp(GeneBank登錄號：MG230317)，通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫在線比對發(fā)現(xiàn)，該菌株rRNA-ITS序列與球孢白僵菌(Beauveriabassiana) CCTu0007 (Genebank登錄號：KM249032)等的序列高度相似。從圖2可見，分離菌株與多個球孢白僵菌聚為一類，其相似度99%以上，表明親緣關系最近。其中，8株球孢白僵菌聚在一個較大的分支上，和布氏白僵菌(BeauveriabrongniartiiCCRC32838)分屬于白僵菌的不同進化支，而蠟蚧輪枝菌作為外群處于一個單獨的分支，與白僵菌的親緣關系最遠。結合對分離菌株分生孢子和菌落形態(tài)的觀察結果，確定該菌株為球孢白僵菌，命名為BeauveriabassianaNB。

圖2 采用ML法構建不同來源白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹NFig.2 Phylogenetic dendrogram of B.bassiana strains from different source based on ML method

2.3 白僵菌在人工飼養(yǎng)僵蠶中的應用

從圖3可見，在噴施時間、環(huán)境溫濕度完全一致條件下，不同濃度處理家蠶僵化死亡率差異明顯，隨濃度遞減其死亡率呈遞減，發(fā)病死亡時間呈遞增的線性關系。其中，濃度為1×108個/mL時家蠶染病死亡最快，處理4～5 d即集中死亡，第5天死亡率達100%；濃度為5×105個/mL時家蠶染病、死亡較慢，處理4 d時尚無死蠶，至第7天死亡率僅40%。從圖4可知，BeauveriabassianaNB的最佳施用濃度為(1～5)×107個/mL，該濃度下家蠶僵化死亡率達98%，且僵蠶平均單條重為0.9 g，僵蠶收益率最高。

圖3 不同濃度白僵菌接種5齡蠶的僵化死亡率NFig.3 Inactivation mortality rate of B.mori larvae with 5th instar inoculated with different concentrations of B.bassiana NB

圖4 不同濃度白僵菌接種5齡蠶僵蠶的平均單條重量NFig.4 Average weight/stiff larva from B.mori larvae with 5th instar inoculated with different concentrations of B.bassiana NB

3 結論與討論

該研究在廣泛收集、分離僵病致病菌的基礎上，分離鑒定得到1株球孢白僵菌(BeauveriabassianaNB)。其最佳施用濃度為(1～5)×107個/mL，該濃度下家蠶僵化死亡率達98%，且僵蠶平均單條重為0.9 g，僵蠶收益率最高。研究結果為僵蠶人工規(guī)模化飼養(yǎng)提供了科學合理的致病病原及其最優(yōu)施用濃度，確保了僵蠶收益最大化。

僵蠶致病白僵菌菌株眾多，目前已報道的菌株有球孢白僵菌、卵孢白僵菌及布氏白僵菌。不同菌株的生物學特性差異較大，其生長速度、產孢量和毒力高低不盡相同[14]。因此，后期研究有必要對僵蠶白僵菌進行評價，從僵蠶收益率和僵蠶藥效等方面綜合考慮，確定可用于規(guī)模化人工飼養(yǎng)僵蠶的最優(yōu)白僵菌菌株。