戈寶紅麻葉片水提物的抗氧化作用

張孟麗， 張衛明， 束成杰*

( 1.南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京 210023；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100)

戈寶紅麻(ApocynumvenetumL.var.aletaienseH.T.Lau，var.nov.)為多年生草本植物，宿根正常可存活30 a左右，根系發達，具有極強的抗逆性，是美化沙漠、防風固沙、涵養水源、改善局域環境最好的生態植物[1]。戈寶紅麻含有黃酮類、糅質、甾體類、有機酸類、氨基酸等活性成分，其具有解郁安神、降血壓、降血脂、抗氧化等功效[2-3]。

機體氧化衰老在自然界是不可逆的，其機制復雜。隨著人們健康意識的增強，逐漸認識到化學合成抗氧化劑的危害，天然抗氧化劑由于具有天然、高效、低毒的特點逐漸為人們所利用并取代人工合成抗氧化劑。天然抗氧化劑是直接從天然生物中提取的抗氧化劑，對人的副作用和傷害較小，因此國內外對天然抗氧化物質的研究越來越多[4]。秀麗隱桿線蟲作為經典模式生物，由于自身結構簡單，易于培養，廣泛應用于人類遺傳學疾病、藥物篩選、衰老與壽命、信號傳導等各個領域[5-6]。筆者通過體外研究戈寶紅麻葉片水提物的抗氧化活性，借助秀麗隱桿線蟲通過體內研究其抗衰老作用，以期為戈寶紅麻葉片的高值高效利用，開發抗氧化、降低血糖血脂等功能性食品及保健品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 戈寶紅麻葉片、線蟲與菌株 戈寶紅麻葉片為成熟期戈寶紅麻葉片，采自新疆阿勒泰地區；秀麗隱桿線蟲為野生型N2，大腸桿菌菌株E.coliOP50(尿嘧啶缺陷型)，均由南京野生植物綜合利用研究院提供。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麥克林公司)，瓊脂、多聚蛋白胨(日本制藥株式會社),超氧化物歧化酶測試盒、過氧化氫酶測試盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國產分析純。儀器：電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司),T6紫外/可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器廠),奧林巴斯顯微鏡(OlympusBX41，南京艾朗儀器有限公司),渦旋震蕩器(上海珂淮儀器有限公司),SPX-150B-Z型生化培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠),BG-50隔水式培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠),JW-25017HR高速冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司),JSZ6系列連續變倍體視顯微鏡(江南永新光學有限公司),紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司),酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品液制備 將戈寶紅麻葉片除雜干燥，粉碎，稱取粉末50 g，共2份，加入8倍體積水，80℃回流提取3次，每次1 h，合并提取液，5 000 r/min離心10 min，過濾放至室溫，減壓回收溶劑，收集濾液；分別將戈寶紅麻水提液置于真空冷凍干燥箱中干燥，得葉片水提物固體粉末，復溶。

1.2.2 體外抗氧化試驗

1) 清除DPPH自由基。將戈寶紅麻水提物配置成1 mg/mL起始濃度備用。再將樣品溶液及標準維生素C(VC)依次配置成濃度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL和1 000 μg/mL的溶液，標準VC作陽性對照。用70%乙醇溶液配置成0.1 mmol/L DPPH溶液500 mL，放置于4℃冰箱保存。依次向10 mL試管中加入DPPH溶液4.0 mL、提取物0.2 mL，混勻后置于暗處放置30 min，測吸光度值A1；同時用70%乙醇代替DPPH溶液4.0 mL為樣品空白，測吸光度值A2；用70%乙醇溶液0.2 mL代替抗氧化物作空白對照，測吸光度值A0，用蒸餾水做參比，在波長510 nm下比色，最后計算清除率[7-8]。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

2) 清除超氧自由基(O2-·)。將戈寶紅麻水提物配置成1 mg/mL起始濃度備用。再將樣品溶液及標準VC依次配置成濃度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL，標準VC作陽性對照。分別取50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL于10 mL試管中，放入25℃水浴中預熱20 min，分別加入提取液2.0 mL，再加入25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混合后在25℃水浴條件下反應4 min，后立即加入2滴8 mmol/L HCl終止反映，同時設定空白組和樣品空白組，用蒸餾水做參比，在波長320 nm下比色，最后計算清除率[9]。

3) 還原能力。將戈寶紅麻水提物配置成1 mg/mL起始濃度備用。再將樣品溶液及標準VC依次配置成濃度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL的溶液，標準VC作陽性對照。分別取各溶液2.0 mL，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液 (pH 6.6) 2.0 mL，再加入1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，混合后在50℃水浴中反應20 min。取出后在混合物中加入10%三氯乙酸2.0 mL，再分別從中取出2.0 mL混合物，加蒸餾水2.0 mL和0.1%三氯化鐵0.4 mL于試管中，用蒸餾水稀釋至20 mL，反應10 min后于700 nm處測定吸光度值[10]。

1.2.3 基于秀麗隱桿線蟲的體內抗氧化試驗

1) 秀麗隱桿線蟲生長培養基(NGM)的配制。氯化鈉3 g，瓊脂粉17 g，多聚蛋白胨2.5 g，加入蒸餾水975 mL，高壓滅菌。加入1 mol/L氯化鈣1 mL，1 mol/L硫酸鎂1 mL，磷酸鉀緩沖液25 mL，待冷卻至50℃左右時加入5 mg/mL膽固醇1 mL，搖晃混勻后倒入紫外滅菌后的培養皿內[9]。

2) 秀麗隱桿線蟲同步化。當秀麗隱桿線蟲體內出現大量蟲卵時，加入秀麗隱桿線蟲裂解液(10%次氯酸∶1 mol/L氫氧化鈉=1∶1)，離心，洗滌，放置涂有直徑1 cm大腸桿菌E.coliOP50的培養基上，20℃培養48～60 h，得年輕成蟲[11]。

3) 秀麗隱桿線蟲暴露方法。將同步化后的秀麗隱桿線蟲轉移到含有大腸桿菌E.coliOP50的新培養基中，對照組加入M9緩沖液，暴露組分別加入濃度為10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL和1 000 μg/mL戈寶紅麻葉片水提物，20℃處理24 h，然后進行后續試驗。

4) 水提物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響。隨機挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至含有大腸桿菌E.coliOP50的培養基上，每組33條，同時設對照組，3次重復，在20℃條件下培養。將秀麗隱桿線蟲從培養基上洗下當天起計算存活天數，并每天記錄存活和死亡條數，持續至最后1條死亡為止，以鉑金絲碰觸秀麗隱桿線蟲仍然不動即判定為死亡。根據線蟲生存、死亡的條數繪制曲線[12-13]。

5) 水提物對秀麗隱桿線蟲頭部擺動的影響。隨機挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至含M9緩沖液的空白培養基上，觀察其頭部擺動頻率。觀察前先讓秀麗隱桿線蟲自由擺動恢復1 min，在顯微鏡下觀察并記錄1 min內的頭部擺動次數，作為頭部擺動頻率指標，每組觀察15條，同時設對照組，3次重復。1次頭部擺動定義為其頭部擺動方向改變，改變必須轉過其身體朝向方向[14]。

6) 水提物對秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響。隨機挑取15條暴露后的秀麗隱桿線蟲至涂有大腸桿菌E.coliOP50的培養基上，同時設對照組，觀察其吞咽頻率，在奧林巴斯高倍顯微鏡下觀察并記錄1 min內秀麗隱桿線蟲的吞咽次數，作為吞咽頻率指標，3次重復[14]。

7) 水提物對秀麗隱桿線蟲排泄周期的影響。隨機挑取15條暴露后的秀麗隱桿線蟲至涂有大腸桿菌E.coliOP50的培養基上，同時設對照組，將每條秀麗隱桿線蟲取出觀察，當體壁肌肉伸縮排泄到下一次排泄的時間即為排泄周期，在奧林巴斯高倍顯微鏡下觀測，3次重復[15-16]。

8) 水提物對秀麗隱桿線蟲3種抗氧化酶活力水平的影響。準確稱取對照組與處理組秀麗隱桿線蟲全部組織質量，按質量(g)∶體積(mL)=1∶10的比例，加入12倍體積生理鹽水，冰水浴條件下手動勻漿，5 000 r/min離心5 min，取上清液待測；各組秀麗隱桿線蟲超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)活性的測定，嚴格按照南京建成生物工程研究所生產試劑盒說明書進行[17-19]。

1.3 數據處理

試驗數據用平均值±平均標準誤差(S.E.M)表示，用Microsoft Excel軟件繪制柱形圖，用SPSS 12.0軟件進行不同組別間方差分析(ANOVA)，壽命試驗運用2尾檢驗中的兩樣本t-檢驗(Minitab Ltd.，Coventry，UK)。

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化效果

DPPH自由基是一種穩定的自由基，因其結構簡單，反應體系容易控制，多被應用于各種物質提取物或純化合物抗氧化活性的評價和篩選[20]。O2-·是人體內產生的活性氧自由基，能引發體內脂質過氧化，加快從皮膚到內部器官整個肌體的衰老過程，并可誘發皮膚病變、心血管疾病、癌癥等，嚴重危害人體健康，人體通過超氧化物歧化酶(SOD)將其轉化成過氧化氫和氧氣除去[21]。從圖1可知，戈寶紅麻葉片水提物對DPPH、O2-·均具有一定的清除效果，清除率與濃度呈正相關；對DPPH清除率達50%的濃度為1 000 μg/mL，相當于80 μg/mL濃度下Vc 的清除率。

還原力也是清除自由基能力評價的一個指標，依據產物生成量作為評價還原力的指標，OD值越大表明還原力越強。還原能力較強的物質，能夠提供更多的電子，其供應的電子能夠參與自由基反應將其變為穩定物質[21-22]。戈寶紅麻葉片水提物具有較好的還原力，隨著劑量增加還原力逐漸增強(圖1)。

2.2 體內抗氧化效果

從圖2可看出戈寶紅麻葉片水提物不同濃度對秀麗隱桿線蟲的壽命、頭部擺動頻率、排泄周期和吞咽頻率和抗氧化酶活力的影響。

圖1 戈寶紅麻葉片水提物的還原力及對自由基的清除效果Fig.1 Reducing power and DPPH scavenging activity of aqueous extract from A. venetum leaves

注：與對照(CK)組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: * and ** indicate significance of difference at P<0.05 and P<0.01 level respectively.

2.2.1 壽命 壽命是秀麗隱桿線蟲經藥物處理前后變化最直接的反映。與對照組相比，戈寶紅麻葉片水提物10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL和1 000 μg/mL能顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命和半數致死天數，且壽命與濃度呈劑量效應。

2.2.2 頭部擺動頻率 秀麗隱桿線蟲經藥物處理后，其神經系統等功能會發生改變，頭部擺動作為秀麗隱桿線蟲的運動行為之一，可作為反映神經系統基本功能的指標。與對照組相比，戈寶紅麻葉片水提物不同濃度處理均能顯著提高秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率，且隨濃度增加呈先上升后下降趨勢，其中，以500 μg/mL處理秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率最高。表明，戈寶紅麻葉片水提物能降低秀麗隱桿線蟲的機體氧化，保護神經系統功能。

2.2.3 排泄周期 是評價秀麗隱桿線蟲抗氧化的重要指標，生長狀態越好其代謝能力越強，排泄周期越短。與對照組相比，戈寶紅麻葉片水提物處理均能顯著縮短秀麗隱桿線蟲的排泄周期，其中以500 μg/mL處理的排泄周期最短。表明，500 μg/mL戈寶紅麻葉片水提物能較好地維持秀麗隱桿線蟲的代謝能力，提高機體抗氧化水平。

2.2.4 吞咽頻率 能反映秀麗隱桿線蟲的攝食能力，并且秀麗隱桿線蟲的壽命可以通過咽泵運動速率間接進行評價[24]。與對照組相比，戈寶紅麻葉片水提物10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL處理均能增加秀麗隱桿線蟲的吞咽頻率，其中，100 μg/mL和500 μg/mL處理增加顯著；1 000 μg/mL處理的吞咽頻率顯著下降，與對秀麗隱桿線蟲壽命影響相統一。

2.2.5 抗氧化酶活力 抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，SOD對機體的氧化與抗氧化水平起至關重要的作用，能清除超氧陰離子自由基保護機體免受損傷；CAT能有效清除各種活性氧基團，從而防止這些基團對細胞膜系統的破壞。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變為氧化型GSH，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害[24]。抗氧化酶活力增強，則抗氧化能力增強。與對照組相比，戈寶紅麻葉片水提物10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL處理秀麗隱桿線蟲的SOD、CAT、GSH活力均逐漸增強，而1 000 μg/mL處理的活力低于500 μg/mL處理，可能是濃度過高導致秀麗隱桿線蟲出現機體損傷，細胞膜結構破壞，抗氧化能力減弱。

3 結論與討論

戈寶紅麻是羅布麻的一種，是我國傳統的補益藥，其味甘性平，具有補中益氣、抗缺氧、耐疲勞、增強機體免疫力等多種作用。通過抗氧化體外試驗發現，戈寶紅麻葉片水提物對DPPH、O2-·自由基均具有一定的清除能力，且隨質量濃度的升高清除效果增強；還原力與水提物濃度呈劑量效應，其中，以500 μg/mL水提物清除自由基的效果最好，說明戈寶紅麻水提物在體外具有良好的抗氧化作用。

在體外研究基礎上，為了證明提取物及純物質在實踐應用上的價值，前人多采用小鼠進行體內試驗及系列指標測試。隨著科技水平的不斷進步，秀麗隱桿線蟲因其結構簡單，易于飼養，作為一種模式生物已在各個領域得到廣泛應用。因此，利用模式生物秀麗隱桿線蟲的壽命、抗氧化酶活力等體內各項試驗指標研究發現，戈寶紅麻葉片水提物能提高秀麗隱桿線蟲的抗氧化能力，10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL能極顯著增強其體內GSH-Px和CAT的活力，顯著提高SOD的活力，其中以500 μg/mL處理的效果最好。田立等[25]研究發現，羅布麻體外具有良好的抗氧化能力及其適量多糖抑制小鼠機體過氧化物的產生。由此表明，戈寶紅麻葉片水提物良好的抗氧化活性可能與其水提物中多糖有很大關系。研究結果為戈寶紅麻天然保健品的開發利用提供了理論依據。