熒光定量PCR 在非洲豬瘟檢測中的常見問題與解決方案

孫華偉，張敬峰＊

（江蘇省農業科學院獸醫診斷檢測重點實驗室，江蘇 南京 210014）

由于熒光定量PCR（Q-PCR）具有極高的靈敏性[1]，極容易受到污染，所以其對實驗室的配置和操作人員的要求更為苛刻。現將Q-PCR 在非洲豬瘟檢測過程中遇到的常見問題與解決方案和大家分享如下。

1 Q-PCR 的CT 值顯示異常

Q-PCR 是利用熒光信號的變化實時檢測PCR 擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過CT 值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。擴增曲線反應了Q-PCR動態進程的曲線；熒光閾值是以前15 個循環信號作為熒光本底信號（baseline），一般熒光閾值的默認設置是3 ～15 個循環的熒光信號的標準偏差的10 倍；CT 值是PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數，見圖1。

1.1 陽性對照或陽性樣品不顯示CT值及解決方案

圖1 Q-PCR 擴增曲線示意圖

部分檢測機構的實驗室人員在進行非洲豬瘟樣品檢測時，時常出現陽性對照有典型的“S”型擴增曲線，但不顯示CT 值（CT 值顯示為Undeter）的情況，出現這種情況的主要原因是儀器默認的熒光閾值線過高。

解 決 方 案。 把Threshold 的Auto 自動取消，設成手動，熒光閾值一般設在PCR 指數擴增的起始，并高于陰性對照曲線。其數值選擇與試劑盒的性能有關，對熒光強度較高的擴增曲線，閾值的設定不一定非要遵循固定的原則。因此，針對試劑盒性能不同，實驗室應建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測結果的穩定性，見圖2。

1.2 檢測樣品無典型“S”形擴增曲線，但其CT 值顯示為陽性及解決方案

被檢樣品無典型“S”形擴增曲線，但其CT 值顯示為陽性（按照試劑盒說明書CT 值判定標準）的情況在實際檢測過程中出現的頻率更高，出現這種情況的主要原因大多是由于被檢樣品不夠新鮮或經反復凍融等。

圖2 Q-PCR 閾值線手動設置示意圖

解決方案。經過對部分實驗室的實地調研發現，出現上述情況的實驗室在檢測試劑盒提供的陰性對照或無菌無核酸酶水時，則沒有出現“無典型擴增曲線，但CT 值顯示為陽性”的情況，這就說明出現這種情況的主要原因大多是由于被檢樣品不夠新鮮或經反復凍融等，因此被檢樣品要盡量新鮮，4 ～8 ℃保存的血清或抗凝血樣品一般不超過120 h，唾液樣品經離心后再進行檢測，凍融次數一般不超過3 次。

2 實驗過程操作不夠規范

通過實地調研發現不少檢測機構的實驗人員在進行熒光PCR 檢測時，操作很不規范，對于檢測試劑盒的說明書，只知其然而不知其所以然，在遇到問題時也不知該如何解決。

2.1 加樣不規范

1）加入樣品模板及陽性對照前，未進行瞬時離心，致使開蓋時，由于蓋上粘有液體而引起氣溶膠污染；

2）進行加樣時使用的移液器吸頭較短，因移液器的污染而導致樣品間的交叉污染，圖3；

3）加樣時未關閉生物安全柜里的照明燈；

4）加入核酸模板后未盡快上機，致使探針淬滅。

2.2 擴增后處理不規范

1）擴增后，在實驗區域內開啟PCR 反應管，導致試驗區域的氣溶膠污染；

2）檢測過程中用到的吸頭、離心管及PCR 反應管未及時進行清理和高壓處理。

2.3 解決方案

1）在打開裝有PCR 試劑的反應管、陽性對照及樣品核酸模板前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底；謹慎開啟反應管，防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染；

2）對于熒光PCR 檢測，八字原則必須遵守：避光、低溫、快速、蓋緊；即避免強光直接照射反應管，在冰盒上配制反應體系，加入核酸模板后應盡快上機，上機前檢查反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄漏污染儀器；

3）檢測過程中用過的吸頭請直接丟入裝有1%次氯酸鈉的廢物缸內，與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄，在檢測結束后用核酸去除劑噴灑實驗室臺面（圖4）。

圖3 10ul 不同長度的移液器吸頭

圖4 核酸清除劑