水稻條斑病抗感品種根際微生物群落結構和功能分析

楊俊, 王星, 付麗娜, 汪婭婷, 劉棋, 苗新利, 王凡, 魏蘭芳, 姬廣海*

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水稻條斑病抗感品種根際微生物群落結構和功能分析

楊俊1, 王星1, 付麗娜1, 汪婭婷1, 劉棋1, 苗新利3, 王凡1, 魏蘭芳2, 姬廣海1*

1. 云南農業大學植物保護學院, 昆明 650201 2. 云南農業大學農科基礎實驗教學中心, 昆明 650201 3. 云南省楚雄師范學院數學與統計學院，楚雄 675000

通過抗感水稻細菌性條斑病(簡稱細條病)的品種的水根際可培養細菌群落結構和代謝功能多樣性分析, 探討其根際細菌多樣性差異與水稻抗細條病的相關性。采集孕穗期水稻品種CG2和IR24的植株根際土壤, 采用多種培養基進行可培養細菌的分離、鑒定, 并通過 16S rRNA序列構建系統進化樹; 利用Biolog 技術分析不同品種根際微生物的代謝功能差異。結果顯示: 不同水稻品種的根際土壤可培養細菌分析發現抗病品種CG2以芽孢桿菌為優勢菌群, 而感病品種IR24以節桿菌為優勢種群; 對條斑病菌有抑制的菌株, 篩選后以芽孢桿菌為主, 且抗病品種的比率達47%以上, 而感病材料中只有2.3%; 抗病品種根際微生物群落的Shannon多樣性指數(H′), Shannon均勻度指數(SE), Simpson指數(D), McIntos指數(U)和McIntosh均勻度指數(ME)分別增加了8.80%, 48.49%, 11.76%, 41.88%和0.52%; 主成份分析表明抗病品種CG2的根際土壤微生物與感病品種IR24相比, 對碳水化合物, 氨基酸類、酯類、醇類、胺類和酸類的利用率分別提高了12.52%、66.53%、3.78%、7.49%、27.98%和40.67%。研究表明, 從根際土壤細菌數量和種類上看, 抗病品種CG2的根際土壤細菌數量和種類與感病品種相比, 細菌群落結構多樣性更為豐富, 發揮生防作用的菌群更多, 為水稻條斑病的生物防治提供了思路和資源。

水稻條斑病; 根際微生物; 群落結構; 代謝功能

0 前言

水稻是世界上重要的糧食作物, 尤其是在亞洲。水稻細菌性條斑病是由水稻黃單胞屬()細菌通過氣孔或者傷口入侵寄主植物, 定殖于水稻葉片的薄壁組織細胞間并擴展形成病斑, 病斑不斷融聚導致全葉枯死。近年來, 隨著農業種植環境的改變, 水稻細菌性條斑病形成的危害越來越嚴重, 在中國條斑病引起的水稻減產已經從10%—20%發展到減產40%[1]。

植物內生菌是生存于寄主植物組織中, 與宿主植物建立了共生或互生關系并對植物不造成傷害的一類微生物[2]。植物內生菌可以促進宿主的生長, 增加宿主的抗病、抗逆性, 其種群組成與寄主種類、定殖部位、寄住的生長狀況及生長環境等相關[3]。根際細菌是從根際分離所得, 有研究報道內生細菌來源于根際, 并從根際進入植物組織內部, 有益的根際細菌還能促進植物的能量代謝, 提高寄主的抗病、逆性和合成促進植物生長的激素[4-5]。由此證明, 植物內生細菌與根際細菌具有一定的功能相關性[6-7]。植物根際微生物的種群結構[8-9]和代謝功能特異性對植物寄住的生長發育和抵抗脅迫的影響[10-12], 根際微生物的種群結構和代謝功能的差異對作物的抗病性在棉花、煙草、西瓜和大豆上有所報道。李連洪等對棉花抗黃萎病品種(春矮早和86-6)和感病品種(中棉17和豫棉12)的根際真菌區系進行了分析, 結果表明抗病品種根際微生物的群落結構比感病品種更為復雜, 對枯萎病菌具有抑制作用的真菌種數和比率都高于感病品種, 而且抗病品種根際真菌的優勢種對棉花黃萎病菌的抑制作用較強[13]。蔡秋華等對青枯病和黑脛病不同抗性烤煙品種‘紅花大金元’、‘云煙-87’和‘K326’的群落結構和代謝功能多樣性進行分析, 發現烤煙根際可培養細菌、放線菌數量和微生物總量皆與品種抗性呈正相關, 而真菌數量與品種抗性基本呈負相關[14]。雷娟利等發現西瓜抗枯萎病性與根際細菌的數量具有相關性,在生長發育各個階段, 無論是土培還是基質培養均表現為: 抗病材料的根際細菌數量高于感病材料, 且根際真菌與放線菌數量與西瓜的抗感枯萎病性沒有相關性[15]。陳宏宇等發現對大豆根腐病抗病性不同的大豆品種根際可培養細菌總數存在差異, 抗根腐病品種S10根面可培養細菌數量顯著高于感病品種H25[16]。

目前關于水稻細菌病害的生物防治的資源發掘主要集中于水稻內生菌和根際微生物, 很多研究從水稻的葉片、莖內生菌和根際微生物發掘出很多對病害具有生防價值的菌株[17-18], 但針對水稻細菌性條斑病不同抗性水平的水稻品種根際細菌的微生物群落結構和代謝功能差異進行研究的報道鮮有。本研究前期通過抗性篩選得到一個對水稻細菌性條斑病具有高抗水平的水稻秈稻地方品種CG2, IR24作為感病對照品種, 通過對水稻抗感品種的根際可培養細菌的分離、鑒定、群落多樣性和代謝多樣性的差異。對闡述水稻品種、根際有益細菌、病原細菌和環境之間的相互關系有更進一步的認識, 也為抗水稻細菌性病生物資源的挖掘提供依據。

2 材料與方法

2.1 水稻材料

水稻種植于云南省德宏傣族景頗族自治州芒市芒核村水稻實驗田(經緯度N24°25′57′′, E98°32′55′′, 海拔: 837 m), 試驗田采用小區設計, 共6個小區(每個品種各三個小區, 按照單因素隨機區組設計), 每個小區為單一水稻品種, 小區內水稻種植呈3行10列, 行間距25 cm, 列寬20 cm。移栽時間為2017年5月15日。

2.2 土樣采集

采集時間為2017年6月29日, 水稻處于孕穗期, 每個小區采用五點采樣法。采集時掘取整株水稻, 水稻根部土壤掘取至少15 cm的深度, 保持整個根系的完整, 輕輕抖落根系表面的大塊土壤 ,收集附著在根系上的土壤作為根際土壤, 采集后立即將水稻帶回實驗后收集根際土壤, 水稻“CG2”品種根際土壤編號為“CG2”, 水稻“IR24”品種根際土壤編號為“IR”, 收集完成存于4 ℃[19]。

2.3 水稻根際土壤可培養細菌分離

將10 g水稻根際土加入到含90 mL無菌水三角瓶中, 150 r·min-1、28 ℃搖床條件下放置15 min后采用梯度稀釋3次后, 將10-1、10-2、10-3梯度涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基[20], 28 ℃培養24—48 h。待單菌落長出, 進行平板計數后保存于25%甘油的液體牛肉膏蛋白胨培養基中。

2.4 根際土壤細菌16S rRNA 鑒定

采用LB平板復壯保存的單菌落后, 轉接至液體LB培養基(不含瓊脂)中, 160 r/min, 28 ℃培養12 h后, 采用細DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取, 擴增引物為27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’; 1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3’。PCR擴增程序: 94 ℃ 4 min(預變性); 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 35個循環; 72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送昆明碩擎生物科技有限公司測序, 測序結果通過NCBI NBLAST 進行相似性比對, 選取同源性比較高的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象, 構建系統進化樹, 并以屬進行群落結構分析。

2.5 水稻根際土壤細菌對條斑病的抑制作用分析

采用平板對峙法篩選對條斑病病原菌具有抑制作用的根際土壤細菌: 在滅菌培養皿中加入濃度為3×108cfu·mL-1的菌懸液 100 μL, 再加入 20 mL 培養基, 無菌操作臺晾干后, 在平板中心用無菌牙簽接種已培養24 h的根際土壤細菌, 每個菌三個重復, 28 ℃培養, 48 h后觀察結果, 并測量抑菌圈直徑。條斑病菌選用本實驗室已進行致病性測定和基因組測序的菌株YM15。

2.6 根際土壤微生物活性測定及其數據分析

根際微生物代謝功能多樣性采用Biolog-ECO (31 種碳源)進行分析測定。Biolog ECO微平板中具有6 類碳源, 共31 種, 各孔碳源包括糖類10 種, 氨基酸類6 種, 羧酸類 7 種, 多聚物類 4 種, 酚酸類 2 種, 胺類化合物 2 種, 酚類2種。

稱取10.0 g土壤加入90 mL無菌生理鹽水(0.85%)溶液中, 在搖床上振蕩30 min, 4 ℃冰箱靜置10 min, 待分層穩定取上清液梯度稀釋10-3, 取150 μL稀釋液至 Biolog-ECO 板的微孔中, 接種好的平板置于25 ℃恒溫培養, 分別于24、48、72、96、120、144、168 h在Biolog EmaxTM 自動讀盤機上用 Biolog Reader 4.2軟件(Biolog, Hayward, CA, USA)讀取 OD590 nm值[20]. 采用培養 72 h 的數據進行土壤微生物碳源利用分析和主成分分析, 微生物多樣性指數分析采用EXCEL2010, 根際微生物群落的Shannon多樣性指數(H′)Shannon均勻度指數(SE), Simpson指數(D), McIntos指數(U)和McIntosh均勻度指數(ME)的計算方法見(表1)[21], 其中Pi為第i孔的相對吸光值(C-R)與整個平板相對吸光值總和的比率; S為顏色變化的孔的數目; ni是第i孔的相對吸光值(C-R); N是相對吸光值總和。采用軟件PAST進行主成份分析, 各碳源利用情況的熱力圖使用MetaboAnalyst 3.0 在線生成,其中聚類方法中樣本歸類距離為歐氏距離 Euclidean。

3 結果與分析

3.1 水稻根際可培養細菌鑒定

首先通過對培養24 h的培養平板進行單菌落計數, 將分離保存的98株菌進行16S rRNA PCR擴增測序, 經過NCBI同源性比較與相似性達到99%～100%的菌株確定為同一分類學地位, 剔除重復重復序列菌株構建系統進化樹(圖1)。經分析89株細菌集中在以下19個屬, 并且兩個水稻品種的根際細菌

表1 微生物群落多樣性指數計算方法

CG2代表CG2品種的根際可培養細菌, IR24代表IR24品種的根際可培養細菌。

Figure 1 Phylogenetic tree was constructed based on the 16S rRNA gene sequences showing the evolutionary relationships of rice rhizosphere bacteria CG2

3.2 水稻根際土壤可培養細菌拮抗細菌的篩選

上述鑒定得到的單菌落對水稻條斑病病原菌YM15進行抑菌測定, 8株菌對條斑病病原菌YM15具有明顯的抑菌作用, 6株來源于CG2, 2株來源于IR24, 除菌株F為Microbacterium屬, 其他有抑菌作用的全為Bacillus屬,其中菌株A、C、D、和H的抑菌效果較強, (表3)。

表2 不同水稻品種根際土壤細菌的屬間差異

表3 生防菌對水稻條斑病原菌的拮抗效果測定

3.3 不同品種水稻根際細菌對總碳源的利用情況

平均顏色變化率(AWCD)是反映土壤微生物活性的重要指標。兩個不同抗性品種的根際微生物群落的AWCD值在24 h以前均變化不明顯; 在24 h—120 h之間變化明顯, AWCD值急劇升高; 120 h后, AWCD值趨于平緩達到穩定狀態。在整個培養過程的各個階段, 水稻品種CG2的AWCD值均高于水稻品種IR24, 以培養96 h時AWCD值來比較, 抗病品種CG2比感病品種IR24提高了36%(F=2.28270, P>0.05), 這表明抗病品種CG2的根系微生物的對測試底物的利用能力高于感病品種IR24(圖2)。

3.4 不同品種對根際微生物多樣性指數的影響

不同的多樣性指數可以表示土壤微生物群落利用碳源類型的情況。Shannon多樣性指數評估豐富度和均度; Simpson評估某些最常見種的優勢度指數; McIntosh指數基于群落物種多維空間上的Euclidian距離的多樣性指數, 由McIntosh指數計算得出的均勻度對培養 96 h 各處理土壤進行測定, 計算各品種根際微生物代謝功能多樣性指數。由表 4 可知, 在培養 72 h 后,水稻抗病品種CG2的根際微生物代謝功能多樣性和感病品種IR24相比,抗病品種根際微生物群落的Shannon多樣性指數(H′)Shannon均勻度指數(SE), Simpson指數(D), McIntos指數(U)和McIntosh均勻度指數(ME)分別增加了8.80%(F= 1.766 P-value=0.255), 48.49%(F=3.472 P-value=0.136), 11.76%(F=0.762 P-value=0.432), 41.88%(F=3.689 P- value=0.127)和0.52%(F=0.001 P-value=0.994)。

3.5 不同品種根際微生物對不同類型碳源利用的差異

如圖 3所示, 抗條斑病品種CG2的三個小區根際土壤微生物利用碳源的效率聚為同一類, 同樣的感條斑病品種IR24的三個小區根際土壤微利用碳源的效率聚為同一類。數據分析表明, 抗條斑病品種CG2的根際土壤微生物與感病品種IR24相比, 對碳水化合物, 氨基酸類, 酯類, 醇類, 胺類和酸類的利用率分別提高了12.52%, 66.53%, 3.78%, 7.49%, 27.98%, 和40.67%。

圖2 不同細菌性條斑病抗性水稻品種根際土壤微生物平均顏色隨時間的變化率

Figure 2 Average well color development (AWCD) changes with incubation time of different resistance rice cultivars

表4 水稻抗感品種根際土壤微生物群落代謝功能多樣性指數

注: 同列數據后不同字母分別代表兩個品種在 p<0.05 水平下差異顯著

B1: 丙酮酸甲酯; C1: 吐溫 40; D1: 吐溫 80; E1: α-環式糊精; F1: 肝糖; G1: D-纖維二糖; H1: α-D-乳糖; A2: β-甲基-D-葡萄糖苷;B2: D-木糖; C2: i-赤蘚糖醇; D2: D-甘露醇; E2: N-乙酰基-D-葡萄糖胺; F2: D-葡萄糖胺酸; G2: 葡萄糖-1-磷酸鹽; H2: D,L-α-甘油磷酸鹽; A3: D-半乳糖酸-γ-內酯; B3: D-半乳糖醛酸; C3: 2-羥基苯甲酸; D3: 4-羥基苯甲酸; E3: γ-羥基丁酸; F3: 衣康酸; G3: α-丁酮酸; H3:D-蘋果酸; A4: L-精氨酸; B4: L-天冬酰胺酸; C4: L-苯基丙氨酸; D4: L-絲氨酸; E4: L-蘇氨酸; F4: 葡萄糖-L-谷氨酸; G4: 苯基乙胺; H4:腐胺。CG1~3 分別代表品種CG2的 3 個重復試驗小區, IR1~3 分別代表品種IR24的3 個重復試驗小區。

Figure 3 Utilization of 31 sole carbon sources by microorganisms in rhizosphere soils of different resistant rice variety

以培養96 h的測定數據為依據進行主成分分析。水稻抗病品種CG2根際土壤微生物主成分PC1的變異為 83.7%,主成分 PC2 的變異為 10.9%,兩主成分的總貢獻率為94.6%, 其余的主成份由于貢獻率較小不做分析, 因此主成分PC1和主成分PC2能反映明顯的差異。兩個品種在PC1軸上被較好的分離開,CG2的主要集中于第一、四象限, 相對應的IR24的主要集中于二、三象限(圖4)。結果說不同抗性水平的水稻品種根際土壤微生物的群落對碳源的利用能力不同, 說明兩個品種的群落結構結構有明顯的差異。某一碳源的初始載荷因子決定了該碳源對主成份的影響, 初始載荷因子越大, 則影響越大。根據Choi建立的選擇標準, 在主成份1和主成份2上絕對值大于0.18的載荷因子碳源對主成份有較大影響[22]。

3.6 不同水稻品種根際土壤微生物碳源利用特征的主成份分析

對主成分1影響較大的碳源有10種, 2種為碳水化合物: a-環式糊精(E1),葡萄糖-1-磷酸鹽(G2); 3種為羧酸類: 2-羥苯甲酸(C3), γ-羥基丁酸(E3), 衣康酸(F3); 3種為氨基酸類: L-苯基丙氨酸(C4), L-蘇氨酸(E4), 甘氨酰-L-谷氨酸(F4); 1中為胺類: 腐胺(H4); 1種為醇類: D,L-a-甘油(H2)。10種碳源全部為正相關。

對主成份2影響較大的碳源有4種, 1種碳水化合物: a-D-乳糖(H1)呈正相關; 2種羧酸類: 2-羥苯甲酸(C3)呈負相關, γ-羥基丁酸(E3)呈負相關; 1種胺類: 苯乙基胺(G4)呈正相關(表5)。

4 討論

土壤是植物賴以生存的物質基礎, 土壤中的微生物對植物的生長發育有著直接關系。不同的植物品種和不同土壤性質中的微生物的群落結構有著很大的差異。林文雄等基于基因組總DNA 的T-RFLP 分析旱直播模式下5 葉期和7 葉期化感水稻根際土壤微生物的組成和結構具有差異性, 表明水稻根際微生物受水稻品種和生理期的影響[23]。潘麗媛等對高產示范田和常規水稻田的同一水稻品種的微生物數量進行比較, 高產示范田水稻根際微生物數量是常規水稻田的2倍多, 說明水稻根際微生物越豐富, 水稻越高產; 并且得出細菌絕對優勢菌群, 放線菌, 真菌只占微生物總數的0.16%, 由此證明細菌的群落結構對水稻高產起著重要作用[24]。本研究結果顯示, 水稻條斑病抗性差異品種之間的水稻根際微生物的多樣性存在著差異, 且抗病品種的多樣性和感病品種相比均有增加。

近年來通過研究植物的內生菌和根際微生物與寄主植物互作增加植物對病原菌抗性的研究已有報道, Yanti對大蔥的根際微生物進行分離鑒定, 得到一株粘質沙雷氏菌介導了大蔥對大蔥葉斑病()抗性[25]。Ke對198株根際微生物細菌生物防治不同的植物病害菌進行篩選, 得到28株具有廣譜抗性的根際微生物細菌對四種不同的病原菌引起的植物病害,()引起的番茄瘡痂病(bacterial spot of tomato),()引起的番茄斑點病(bacterial speck of tomato)[26]。本研究從, ()引起的水稻細菌性條斑病(rice leaf streak)作為出發點對水稻抗感品種根際土壤中可培養細菌具有生防能力細菌的種類和數量進行分析發現, 抗病品種“CG2”分離得到克雷伯菌屬(), 新鞘氨醇桿菌屬()和鏈霉菌屬()菌, 而在感病品種根際土中并未分離得到, 這三個菌屬在以往的研究中多報道為具有生防潛力的有益菌[27–29], 是否是這些菌屬的存在對水稻的抗性有影響需要更深入的研究; 對兩個品種中“CG2”水稻根際土壤細菌中對具有抑菌作用的主要菌屬為芽孢桿菌屬, 從篩選的結構來看, 抗病品種根際土壤可培養生防菌數量比感病品種多, 對抗病品種的抗病是否起到作用及作用機制有待進一步的研究。

圖4 不同抗性水稻根際微生物碳源利用特征的主成分分析

Figure 4 Principal components analysis of carbon utilization profiles in different resistance rice rhizosphere microbial community

表 5 抗條斑病水稻品種與感病品種根際土壤微生物對 31 種碳源利用在主成份1、主成份2 上的載荷(Loading>0.18 和 Loading<-0.18)

5 結論

本研究以水稻抗水稻細菌性條斑病抗性差異品種的根際土壤微生物作為研究對象, 對根際土壤中可培養的細菌分離和分子生物學鑒定, 利用采用平板對峙法篩選對具有抑制作用的生防菌, 平板計數法明確抗感水稻品種根際土壤可培養細菌的群落結構, 結合Biolog ECO微生物多樣性分析系統對抗感水稻品種的代謝功能差異經行分析, 最后得出以下結論:

水稻抗感細菌性條斑病品種的根際土壤可培養細菌群落結構存在很大的差異, 抗病品種CG2的細菌屬中作為生防菌的居多, 且直接有抑菌作用的菌株數量也更多; 從根際土壤微生物生代謝多樣性分析, 抗病品種CG2的各種多樣性指數葉高于感病品種CG2。這不僅為水稻細菌性條斑病的生物防治提供了思路和資源, 也為植物、根際微生物與病原微生物之間互作關系提供理論基礎, 能更好的利用生態多樣性對病害進行控制。

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Study on rhizosphere microbial community and functional diversity of different resistant rice varieties to rice leaf streak disease

YANG Jun1, WANG Xing1, FU Li-na1, LIU Qi1, MIAO Xinli3, WANG Fang1, WEI Lanfang2, JI Guanghai1*

1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 2. Experimental Agricultural Center, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 3. School of Mathematics and Statistics，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000, China

We analyzed the rice rhizosphere microbiome composition and metabolism of different resistance rice cultivars, to explore the relationship between the rhizosphere soil microbial diversity and resistance to rice bacterial leaf streak. We collected the rhizosphere soil of plants CG2 and IR24 rice varieties in booting stage, using a variety of culture medium to cultivate bacteria isolation, purification, counting, and through the 16S rRNA homology comparison and phylogenetic tree analysis, and microbial metabolic function difference was studied by using Biolog. The results showed that 1057 single colony different varieties were isolated from the culture medium, andthey were divided into 15 types, 6 genera:,,,,,. Plate count in rhizosphere soil of different rice varieties of culturable bacteria showed bacillus was the dominant species in resistance cultivar CG2 and Arthrobacter was dominant species in the susceptible cultivar IR24. Shannon diversity index () and Shannon evenness index (), Simpson index (), McIntos index () and McIntosh evenness index () of the rhizosphere microbial community of resistance cultivar CG2 were increased by 8.80%, 48.49%, 11.76%, 41.88% and 0.52%, as compared to the susceptible cultivar IR24.The principal component analysis showed that the use of carbohydrates, amino acids, esters, alcohols, amine and acid were increasedby 12.52%, 66.53%, 3.78%, 7.49%, 27.98%, and 40.67% for the resistance cultivar CG2 rhizosphere soil microorganisms as compared with susceptible variety IR24. The research shows that the colony number and kind of the resistant cultivars CG2 rhizosphere soil bacteria are more than the susceptible cultivars IR24. The bacterial diversity is more abundant; the community structure is more stable; niche competition is stronger than pathogenic bacteria. The results can provide ideas and resources for the biological control of rice bacterial leaf streak.

rice leaf streak; rhizosphere microbial; community structure; metabolic function

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.01.003

X172

A

1008-8873(2019)01-017-09

2018-01-08;

2018-03-20

云南省科技廳農業基礎研究聯合專項項目(2017FG001-005); 國家重點研發計劃(2018YFD0200308); 國家重點研發計劃項目 (2018YFD0200703); 國家重點研發計劃項目(2017YFC1702502); 國家自然基金(31460458).

楊俊( 1989—), 男, 云南楚雄人, 博士研究生, 從事植物微生物互作研究。729747016@qq.com

姬廣海, 男, 博士, 教授,主要從事農業微生物微生物生態學研究 E-mail: jghai001@aliyun.com

楊俊, 王星, 付麗娜, 等. 水稻條斑病抗感品種根際微生物群落結構和功能分析[J]. 生態科學, 2019, 38(1): 17-25.

YANG Jun,WANG Xing, FU Li-na, et al. Study on rhizosphere microbial community and functional diversity of different resistant rice varieties to rice leaf streak disease[J]. Ecological Science, 2019, 38(1): 17-25.