湖北黃石典型水域超微型真核浮游生物多樣性研究

于佳駿, 段鈺涵, 劉科賽, 劉細霞, 侯建軍, 李運濤

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湖北黃石典型水域超微型真核浮游生物多樣性研究

于佳駿, 段鈺涵, 劉科賽, 劉細霞, 侯建軍, 李運濤*

湖北師范大學, 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室, 黃石 435002

為探討湖北省黃石市典型水域中超微型真核浮游生物多樣性, 采用18S rDNA 擴增片段限制性酶切技術, 結合優勢類群測序及相關統計學分析, 對2015年夏季湖北黃石境內營養程度不同的典型水域(長江, 磁湖, 青山湖, 青港湖)中超微型真核浮游生物的群落組成及遺傳多樣性進行了研究。結果表明, 4個水域的超微型真核浮游生物多樣性有明顯差異, 多樣性隨水域營養化程度的增高而降低。優勢克隆的測序結果顯示, 優勢類群藻類包括隱藻、綠藻、甲藻, 真菌包括隱真菌和壺菌, 此外還有纖毛蟲及未分類的浮游生物, 隱藻在4個水域中都占優勢。不同水域的優勢類群差別較大。優勢類群的種類隨水域營養化程度的增加而減少。群落的多樣性與總磷呈極顯著的負相關。

超微型真核浮游生物; 生物多樣性; ARDRA技術; 淡水水域

0 前言

超微型浮游生物是指粒徑小于或等于5 μm的浮游生物[1], 它們作為生態系統中不可缺少的重要環節[2-3], 具有生長快、數量多、周轉速率高的特點, 雖然個體微小, 但仍然可維持相當高的生產力[4–5]; 它們還可以通過被捕食而進入經典食物網[6]。超微型浮游生物可以作為水體營養狀態的判斷依據[7]。

隨著經濟社會的發展, 城市人口急劇增長, 生活生產過程中產生的各種污染物, 超過了城市自然環境的自凈能力, 引起城市水域污染。城市水域的水質惡化會直接影響水中的浮游生物的種類和多樣性。關于這方面的研究已有不少報道。梁迪文等對廣州市不同類型水體輪蟲群落結構進行了研究, 結果表明不同類型水體之間群落差異顯著[8]。龔珞軍等測定了武漢市5個養殖湖泊的浮游生物的數量和生物量, 根據浮游生物的種類和數量, 5個湖泊可以劃分為不同的類群, 形成這個結果是由城市廢水、生活污水和養殖生產所致[9]。目前, 關于城市不同類型水域中超微型真核浮游生物的研究比較少, 而這些研究有助于了解水體污染情況。

黃石市位于長江中游南部, 長江流經市區, 市區有磁湖等較大的湖泊。由于沿岸工礦企業較多, 污染問題比較突出, 但不同水域的污染程度不盡相同。關于黃石市轄水體中超微型真核浮游生物群落結構的研究尚缺乏, 故湖北黃石附近水域可以作為研究城市不同類型水域中超微型真核浮游生物的一個樣本。本研究擬對黃石市典型水域(長江, 磁湖, 青山湖, 青港湖)中的超微型真核浮游生物的多樣性進行初步調查, 分析水質與超微型浮游生物多樣性的關系, 以探究污染程度不同的城市水域中的超微型真核浮游生物優勢類群及多樣性有何差異。研究結果可加深對淡水水域浮游生物多樣性的理解, 并為城市水域水質污染評價和可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

結合前期對黃石水域的調研, 選取黃石境內4個營養程度不同的水域(長江、青山湖、青港湖、磁湖)作為研究站點(圖1)。采樣于2015年8月進行, 采集0.5 m內表層水樣。每個研究站點各設置3個站點, 每個站點采集500 mL水樣, 3個站點的水樣混合后, 用200 μm篩絹進行初步過濾。濾液用5 μm的Isopore(Millipore)聚碳酸酯濾膜進行二次過濾, 二次過濾后的濾液再用GF/F膜(Whatman, 0.7 μm)進行過濾。吸干水分的GF/F濾膜置入-70 ℃超低溫冰箱保存。

圖1 采樣站點分布圖 (A: 磁湖; B: 長江; C: 青山湖; D: 青港湖)

Figure 1 The location of sampling sites (A: Cihu lake; B: Changjiang river; C: Qingshan lake; D: Qinggang lake)

現場用溫度計測量水溫, 其余項目采集后24 h內在實驗室監測, 總氮、總磷、氨氮、化學需氧量(COD, 高錳酸鉀指數)按《水和廢水監測分析方法》(第4版)進行分析。pH值的測量采用上海雷磁PHSJ-4F型pH計進行。水中懸浮物的測定采用重量法, 參照《水質懸浮物的測定》(GB11901-1989)進行。

1.2 基因組DNA提取

保存的膜樣品剪碎放于離心管中, 每管加入700 μL預熱裂解緩沖液(1.0 mol·L-1NaCl; 50 mmol·L-1EDTA; 50 mmol·L-1Tris; 1% PVP), 混勻后65 ℃恒溫水浴30 min, 水浴結束后12000 g離心5 min, 取上清液, 加入1/5倍體積的5×CTAB, 65 ℃水浴10 min,接著加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1), 12000 g 4 ℃離心10 min, 取上清液, 加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1), 12000 g 4 ℃離心10 min, 取上清液, 加入1/10體積3 M醋酸鈉, 混勻, 加2倍體積-20 ℃預冷的無水乙醇, 于-20 ℃放置1 h, 12000 g離心10 min, 去除上清液, 加入1 mL 70%乙醇, 12000 g離心5 min, 去上清液, 干燥, 加入30 μL的無菌水, –20 ℃保存。

1.3 18S rDNA文庫的建立

以提取的樣品基因組DNA為模板, 擴增18S rDNA使用真核生物通用引物Euk328f(5`-ACCTG GTTGATCCTGCCAG-3`)和Euk329r (5`-TGATCC TTYGCAGGTTCAC-3)[10], 擴增片斷長度約為1.8 kb。PCR反應條件為:(94 ℃, 60 s; 55 ℃, 60 s; 72 ℃, 90 s)×20, 每循環退火溫度降0.5 ℃; (94 ℃, 60 s; 55 ℃, 60 s; 72 ℃, 90 s)×10; 72 ℃, 10 min。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用DNA凝膠純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化擴增后的18S rDNA片斷, 將純化后的DNA片斷與pGEM-T Easy Vector載體(北京普洛麥格生物技術有限公司)連接, 連接產物的克隆按通用分子生物學方法進行。隨機選取一定數量的白色克隆子, 采用菌體直接擴增方式, 用Euk328f/Euk329r引物檢測陽性克隆子。

1.4 ARDRA分析

以限制性內切酶HaeIII(上海賽默飛世爾科技有限公司)消化從各個陽性克隆子擴增出的18S rDNA片斷。酶切反應結果用凝膠成像儀觀察, 電泳圖譜照片用Image lab 5.0軟件分析。

1.5 數據分析

采用綜合營養狀態指數(trophic level index,)法來評價各水域的富營養化程度。選取總氮濃度()、總磷濃度()、高錳酸鹽指數(COD)這3個指標作為參數用于計算綜合營養狀態指數, 具體計算方法參考王鶴揚的方法[11]。采用0—100的一系列連續數字對營養狀態進行分級,()<30貧營養; 30≤()≤50中營養;()>50富營養; 50<()≤60輕度富營養; 60<()≤70中度富營養;()>70重度富營養。

將酶切結果中數目和大小均相同的片段歸為同一個操作分類單位(Operational taxonomic unit,)。分別計算每個文庫的覆蓋率()、多樣性指數()、均勻度指數以及優勢度指數。優勢度指數()計算公式為:=(/)[12], 式中為克隆文庫中某種數量,為克隆文庫中所有類型數,為某種在各站點中出現的頻率, 當>0.02時, 該即為優勢。文庫覆蓋率計算公式為[13]:=[l-(/)]×100%, 其中為克隆文庫中只出現一次的類型數,為克隆文庫大小。指數及均勻度指數的計算使用R 3.3(vegan包)。使用R 3.3軟件(vegan包), 非加權組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)以及Bray- Curtis距離對4個樣本進行聚類分析; 使用Canoco 5軟件, Bray-Curtis距離進行非度量多維尺度分析(Nonmetric multidimensional scaling, NMDS)。相關性分析采用SPSS 24軟件, 使用 Pearson相關系數進行分析。

2 結果與分析

2.1 多樣性分析

總共對4個文庫中的362個克隆進行了酶切分析(表1)。酶切的結果一共可以劃分為106個。4個水域共有的只有1個, 特有數目最多的水域是長江, 最少的是青港湖(圖2)。不同水域之間存在著同一, 但同一在不同水域中分布卻不同。其中只有一個克隆子的有46個, 有兩個及兩個以上克隆子的有60個。

分別計算了4個文庫的覆蓋率,多樣性指數和均勻度指數(表1, 表2)。四個站點中只有長江的覆蓋率低于70%, 說明總體的文庫覆蓋率還比較大; 青港湖的覆蓋率最大, 但是豐富度卻最小, 說明青港湖夏季的物種比較單一, 而其他的三個站點豐富度均達到了8以上, 表明這些站點夏季物種較豐富。

4個站點中, 磁湖的多樣性指數和均勻度指數最高, 長江的次之, 青港湖的最低。多樣性指數表明夏季磁湖的多樣性和均勻度最高, 青港湖的最低。

聚類分析結果顯示(圖3), 長江和磁湖聚為1個小的類群, 表明兩者的群落結構相似度最高, 其次是青山湖, 它與長江和磁湖聚為1個稍大的類, 青港湖的群落則自成一類, 表明青港湖的群落結構與其他3個站點的差別較大。NMDS分析得到了和聚類分析類似的結果(圖3)。4個站點中, 長江站點和磁湖站點的超微型真核浮游生物群落結構相似度最高, 青山湖與青港湖的群落結構相似度較小。

圖2 韋恩圖展示四個水域特有和共有的OTU數目

Figure 2 Venn chart showing the number of unique and co-existingin four waters

表1 4個水域的擴增性rDNA限制性酶切片段分析

表2 4個水域的超微型真核浮游生物多樣性指數

2.2 優勢類群分析

測序的克隆子共有33個。優勢的測序結果顯示, 目標水域夏季超微型真核浮游生物的優勢類群藻類包括隱藻、綠藻、甲藻, 真菌包括隱真菌和壺菌, 此外還有纖毛蟲及未分類的浮游生物。隱藻中絕大部分都屬于隱藻屬, 綠藻則分別屬于團藻目和小球藻目。

4個水域的浮游生物優勢類群構成情況有明顯的差異, 其中磁湖的優勢群落構成最具多樣性, 青港湖的最為單一(圖4)。隱藻在4個水域中都占優勢, 其中在青港湖中處于絕對優勢(占72%)。綠藻、甲藻以及壺菌只在磁湖中處于優勢, 隱真菌只在青山湖中處于優勢, 此外每個水域中都存在很多未分類的浮游生物。

圖3 4個水域群落結構聚類分析(左)和NMDS分析(右)

Figure 3 Cluster (left) and non-metric multidimensional scaling analysis (right) of sample community structure

圖4 4個水域的群落結構組成

Figure 4 Community structure diagram of the four waters

2.3 多樣性與理化因子的關系

多數理化因子在4個水域中有明顯波動(表3), 青山湖和青港湖中的化學需氧量、氨氮、總氮和總磷指標要比磁湖和長江中的高。懸浮物在活水長江中比靜水湖泊中的要大。綜合營養狀態指數顯示, 長江和磁湖處于中營養狀態, 而青山湖和青港湖處于富營養狀態, 其中青港湖處于重度富營養狀態。

理化因子與指數的相關性檢驗結果表明總磷、氨氮、總氮、化學需氧量和懸浮物都與指數呈負相關, pH和水溫與指數呈正相關, 其中總磷與多樣性指數呈極顯著負相關(<0.01), 而其他理化因子的顯著系數均大于0.05, 相關性不顯著(表4)。多樣性指數與綜合營養狀態指數呈負相關, 相關系數為0.054(表4)。

3 討論

隨著經濟的發展, 工業、農業和生活的廢水廢物排入水中的排量日益增加, 引起水域污染以及富營養化, 水域的富營養化又會影響浮游生物的多樣性[14–15]。由于超微型真核浮游生物處于食物鏈的底層[16], 其多樣性變化會影響整個浮游生物的群落結構。有些研究表明, 中營養型湖泊中常以甲藻、隱藻、硅藻類占優勢; 富營養型湖泊則常以綠藻、藍藻占優勢[17–21]。我們的結果顯示, 在重度富營養的水體中(青港湖), 隱藻的比例達到了72%, 處于絕對優勢, 綠藻不是優勢類群。關于水域的優勢類群, 我們的結果與別的學者的研究結果不盡相同。造成這種差異的原因可能是: (1)研究所針對的浮游生物粒徑不同。不同粒徑的浮游生物代謝活性及環境適應性不同, 這會導致在相同的環境中不同粒徑的浮游生物生長情況不同。已有研究表明, 同一水域不同粒徑的浮游生物其優勢類群是不同的[22]。(2)水體環境因素的不同。浮游生物的生長受環境因素的影響, 環境因素的差異會導致優勢類群的差異[23]。

本文所研究的4個水域多樣性整體上隨營養化程度的升高而降低(表4)。磁湖多樣性指數最高, 但指數高于長江。分析原因, 可能是長江總磷高于磁湖, 總磷與多樣性指數呈極顯著負相關, 在所有測定的理化因子中對多樣性的影響最大。故長江水域雖然指數低于磁湖, 但長江中較高的總磷影響了浮游生物的多樣性, 使其多樣性指數低于磁湖。這些結果提示不僅水體總的污染水平會影響浮游生物的多樣性, 水體中污染物的類型也會影響多樣性。4個水域的優勢類群也呈現差異。磁湖的優勢類群包括浮游植物、浮游動物以及真菌, 而青港湖的優勢類群只有隱藻, 并且隱藻占絕對優勢(比例大于70%)。這些結果顯示, 水域富營養化會降低超微型真核浮游生物的多樣性和均勻度, 富營養化程度越高, 多樣性越低, 同時優勢類群也越單一。

表3 4個水域的理化因子

表4 理化因子與Shannon-wiener指數的相關關系

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Study on the diversity of eukaryotic ultraplankton in typical water area of Huangshi City

YU Jiajun, DUAN Yuhan, LIU Kesai, LIU Xixia, HOU Jianjun, LI Yuntao*

Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China

In order to investigate the eukaryotic ultraplankton diversity in typical waters of Huangshi City in Hubei Province, the community composition and genetic diversity of eukaryotic ultraplankton in different typical water areas (Yangtze River, Qingshan lake, Qinggang lake and Cihu lake) in Huangshi City of Hubei Province in the summer of 2015 were studied, and amplified ribosomal DNA restriction analysis, DNA sequencing and the related statistical analysis were used. The results showed that there were significant differences in the diversity of the eukaryotic ultraplankton in the four water bodies. Diversity decreased with the increase of the degree of eutrophication in water. Sequencing results of dominant clones indicated that dominant groups were Cryptophyta, Chlorophyta, Pyrrophyta, Cryptomycota, Chytridiomycota, ciliate and some unclassified plankton. The dominant groups were different in different waters, and the phyla of dominant groups decreased with the increase of the degree of eutrophication in water. The diversity of the community was negatively correlated with total phosphorus.

eukaryotic ultraplankton; biodiversity; amplified ribosomal DNA restriction analysis; freshwater

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.01.018

Q89

A

1008-8873(2019)01-137-06

2018-01-29;

2018-03-30

國家自然科學基金項目(No.41171045); 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室開放基金項目; 國家級大學生創新創業訓練計劃項目(No.201510513021); 湖北師范大學創新團隊項目(T201504)

于佳駿(1996—), 男, 內蒙古赤峰人, 學士, 主要從事淡水生態學研究, E-mail: yujiajun96@163.com

李運濤, 男, 博士, 副教授, 主要從事淡水生態學研究, E-mail: liyuntao@hbnu.edu.cn

于佳駿, 段鈺涵, 劉科賽, 等. 湖北黃石典型水域超微型真核浮游生物多樣性研究[J]. 生態科學, 2019, 38(1): 137-142.

YU Jiajun, DUAN Yuhan, LIU Kesai, et al. Study on the diversity of eukaryotic ultraplankton in typical water area of Huangshi City[J]. Ecological Science, 2019, 38(1): 137-142.