沒食子提取物對潰瘍性結腸炎大鼠的治療作用*

美熱古麗·依米提，曹春雨，2，竇勤，李治建，斯拉甫·艾白

(1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種臨床常見且原因不明的炎性疾病，又稱非特異性潰瘍性結腸炎，主要累及到直腸和乙狀結腸，病理表現主要是結腸黏膜和黏膜下層的慢性炎癥細胞的浸潤、隱窩膿腫以及腺體和上皮的損傷為主要特征[1]。臨床上常以腹瀉、黏液膿血便、里急后重和腹痛為主要癥狀，除此外還有發熱、體質量下降、貧血、關節疼痛、皮膚黏膜損傷、腎結石和骨質疏松等多種臨床表現[2]。沒食子是沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂(Cynips gallae-tinctorice Oliv)的幼蟲，寄生于殼斗科植物沒食子樹(Quercus infectoria Oliv.)幼枝上所產成的蟲癭，是維吾爾醫常用藥材，具有清除異常體液的作用，臨床用于治療潰瘍性結腸炎，具有斂腸、消炎止瀉、開通腸阻、促使潰瘍愈合的作用，療效顯著，但其治療UC的作用機制尚未明確。在UC患者中，白細胞介素-6(IL-6)濃度均明顯高于非病變部位[3-9]，IL-6通過激活雅努斯激酶(Janus kinase，JAK)蛋白，間接地導致STAT3高表達，加速潰瘍癌變[10-15]，JAK抑制劑可在一定程度上緩解UC炎癥反應。筆者通過研究沒食子提取物對上述炎癥遞質及相關基因表達的影響，探討其抗UC的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雄性，體質量180～220 g，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(新)2016-0001。實驗動物喂養環境：新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所SPF級動物房。飼養在塑料籠內，每籠飼養性動物不多于5只，自由飲水。相對濕度：40%～70%，室溫：20～26 ℃，光照12 h，實驗正式開始前經檢疫和適應性飼養，選擇健康動物進行造模。

1.2試劑和藥品 沒食子提取物，沒食子藥材(批號：20161112)購自新疆維吾爾自治區維吾爾醫院，新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所藥劑科希爾艾力·吐爾遜研究員鑒定為正品。提取方法：取沒食子，粉碎成粗粉，加8倍量水浸泡1 h后煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，濾過，濾液真空干燥得浸膏，稱質量，計算得率為75%。大鼠IL-6酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，批號：230671122)；大鼠JAK ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，批號：GR201801-1)；DEPC水(上海生工生物工程有限公司，批號：D424BA005)；反轉錄試劑盒(Thermo公司，批號：00374923)；PCR Master MIX(Thermo公司，批號：1706549)；Stat3、IL-6、β-actin(上海生工生物工程有限公司)；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇均為分析純。

1.3主要儀器 自動血液分析儀(Thermo公司)；MuitiskanGo型酶聯免疫檢測儀(Thermo公司)；QGARD00R1型超純水純化系統(Q-Gard 公司)；WH-25型恒溫培養箱(WIGGENS公司)；C1000 touch型PCR儀(Thermo公司)；CFX96型熒光定量PCR儀(Thermo公司)；ND1000型核酸蛋白測定儀(美國NanoDrop公司)；QGARD00R1超純水純化系統(Q-Gard公司，Lot：F4DA29061)；SC-3610型離心機(科大創新股份有限公司中佳分工公司)；ND1000型核酸蛋白測定儀(美國NanoDrop公司)。

1.4造模與分組 取健康SPF雄性SD大鼠80只，適應性飼養1周后，按體質量采用分層法隨機抽取16只為正常對照組，剩下的64只，采用2，4，6三硝基甲苯磺酸(TNBS)一次性局部灌腸制備UC大鼠模型。造模過程：將動物禁食12 h后，采用0.5%戊巴比妥鈉 0.5 mL·(100 g)-1腹腔注射麻醉，將由肛門輕緩插一直徑2.7 mm長約37 cm的橡膠導尿管入直腸深在6～8 cm處注入制備好的造模液，注入造模液后大鼠倒置30 s ，每只0.5 mL·(100 g)-1，讓動物保持俯臥位自然醒的狀態[16-21]。造模后觀察一般情況，包括飲食、體質量、皮毛、大小便、活動情況、精神狀態等并作觀察。造模標準采用參考文獻公認的標準，造模可慢性炎癥性腸疾(inflammatory bowel disease，IBD)造模后1～3 d出現稀便或膿血便，解剖可見結腸部位潰瘍性病變視為模型成功，并伴有精神萎靡、毛發色澤暗淡、活動減少，反應變慢等全身改變[17-21]。造模成功后，分為模型對照組、美沙拉嗪組(美沙拉嗪150 mg·kg-1)，沒食子提取物小劑量組(150 mg·kg-1)、沒食子提取物大劑量組(300 mg·kg-1)，每組16只。給藥體積為1 mL·(100 g)-1，每天一次，連續2周。給藥結束后，腹主動脈取血，取距肛門8～10 cm的結腸作病理檢查。

1.5血清IL-6、JAK的測定 IL-6的檢測：嚴格按照IL-6 ELISA說明書進行測定。JAK的檢測：嚴格按照JAK蛋白ELISA試劑盒進行檢測。

1.6RT- PCR法檢測IL-6、STAT3 mRNA的表達

1.6.1RNA提取 組織標本放入液氮中充分研磨至粉末，研磨后置于EP管中加Trizol 1 mL，混勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL的三氯甲烷劇烈搖蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃12 000 r·min-1，10 min，取上層水相于一新的EP管中，加入異丙醇0.5 mL，室溫放置10 min，12 000 r·min-1，10 min離心，棄去上清液；加入75%乙醇1 mL清洗。4 ℃、12 000 r·min-1，離心5 min后棄去上清，重復操作一次；棄去上清液，室溫或真空干燥5～10 min；加量DEPC水溶解RNA(30 μL)，取RNA 1 μL進行定量純度的鑒定，合格后進行PCR反應。

1.6.2逆轉錄合成cDNA 核酸定量儀測定RNA濃度，取RNA 總量1 μg，配制逆轉錄反應體系：將Oligo dT 1 μL、dNTP 2 μL、ReverAid 1 μL、RNA inhibitor 1 μL、5×Buffer 4 μL、RNA和ddH2O 共11 μL加入無Rnase的PCR管中，42 ℃加熱60 min，再70 ℃ 5 min后，-20 ℃保存備用。

1.6.3實時熒光定量PCR反應 PCR反應體系20 μL：包括dd H2O 8 μL、2×Master Mix 10 μL、上下游引物1 μL及cDNA 1 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環。目標引物序列和內參引物序列見表1。

2 結果

2.1沒食子提取物對UC大鼠血清IL-6和JAK含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組 IL-6水平和JAK蛋白含量均升高(P<0.01)；與模型對照組比較，美沙拉嗪組、沒食子提取物小、大劑量組IL-6 水平和JAK蛋白含量降低(P<0.05)。見表2。

表1 目標引物序列和內參引物序列

表25組UC大鼠血清IL-6和JAK含量的比較

Tab.2ComparisonofIL-6levelandJAKcontentinserumamongfivegroupsofUCrats

組別IL-6(n=16)JAK(n=8)正常對照組121.00±30.36?11038.02±270.01模型對照組232.00±20.481488.24±181.29?1美沙拉嗪組162.10±5.11?21220.94±116.22?2沒食子提取物 小劑量組157.66±9.53?21427.70±207.71 大劑量組144.85±10.09?21238.01±83.09?2

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

2.2沒食子提取物對UC大鼠潰瘍組織IL-6、STAT3基因的影響 與正常對照組比較，模型對照組IL-6、STAT3基因表達升高(P<0.01)；與模型對照組比較，美沙拉嗪組、沒食子提取物大劑量組IL-6表達降低；美沙拉嗪組和沒食子提取物小、大劑量組STAT3表達均降低(P<0.05)。見表3。

3 討論

三硝基苯磺酸所誘導的結腸炎模型因其比較接近于人類又有較好的重復性而被普遍使用，是目前研究的一個重要模型[22]。三硝基苯磺酸作為一種半抗原物質，與結腸膜組織中的大分子組織蛋白結合，形成一種完全抗原，進一步引起機體異常的免疫反應從而誘導腸炎的發生。其致病機制為損傷上皮屏障后由免疫系統介導其疾病的發展且病理及組織學改變均類似于人類炎癥性腸病。在UC患者病變結腸組織中，IL-6濃度均明顯高于非病變部位[3-9]，IL-6通過激活JAK蛋白，間接地導致STAT3高表達，加速潰瘍癌變[10-15]。STAT3是在UC中起重要作用，研究顯示，STAT3的激活在特異性和非特異性免疫中起明顯不同的作用，它與致病及炎癥程度相關[23-27]。細胞生長、分化、增殖和免疫調節等多個關鍵的生物過程都有JAK/STAT信號通路在參與[28-30]。JAK/STAT信號通路還與UC等多種疾病的發病機制密切相關。IL-6細胞因子刺激信號可誘導激活JAK/STAT信號通路，調節細胞核內相關基因的表達，引發相關細胞反應。JAK在炎癥失調中發揮重要作用，JAK抑制劑可在一定程度上緩解UC炎癥反應。而高表達的IL-6，可激活JAK蛋白，增加STAT3表達[31]。研究結果顯示，沒食子提取物能抑制IL-6的分泌。說明沒食子提取物能有效的提高單核/巨噬細胞功能，減少致炎因子的釋放。除了炎癥反應中對促炎遞質的分泌具有抑制的作用，還對機體正常免疫防御功能中又有促進作用、發揮其雙向調節功能。

表35組UC大鼠結腸組織IL-6、STAT3mRNA相對表達量的比較

Tab.3ComparisonoftherelativemRNAexpressionofIL-6andSTAT3incolonsamongfivegroupsofUCrats

組別IL-6STAT3正常對照組1.56±0.560.79±0.24模型對照組11.13±14.83?16.07±1.25?1美沙拉嗪組4.70±3.62?22.17±0.69?2沒食子提取物 小劑量組9.73±6.244.57±1.18?2 大劑量組5.60±2.20?22.56±1.83?2

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

JAK是一類重要的酪氨酸蛋白激酶(PTK)，JAK2 是 JAK 家族中一個重要成員[32]；STAT(signal transducer and activators of transcription)是信號轉導和轉錄激活因子的簡稱，是一類既具有信號傳導功能又有轉錄活化癌基因編碼功能的細胞質蛋白，可以被許多肽類蛋白如生長因子和細胞因子激活[33]。JAK/STAT信號通路在潰瘍到癌癥的疾病的發展及研究中已成為腫瘤治療的靶點，發現多種人類腫瘤如結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤等存在異常活化狀態的STAT3。IL-6 等細胞因子與其特異性受體結合后，JAK2 通過 FERM 結構域與受體相結合并被磷酸化激活，磷酸化的 JAK2 使 STAT3 被磷酸化而活化，活化的 STAT3 形成二聚體并暴露其核定位信號，從而由胞漿轉移到胞核，與其他轉錄調控因子協同調節靶基因的表達，進而影響細胞的增殖、存活、凋亡和血管生成等生理過程。STAT3的激活在人體主要的惡性腫瘤細胞中具有持續高表達的特點，持續激活的STAT3可促進腫瘤細胞無限制生長、抑制腫瘤細胞的凋亡、刺激腫瘤組織內部血管的生長等，這些變化都會加重腫瘤患者的病情。本研究表明，沒食子提取物能抑制IL-6、STAT3的逆轉錄水平，也能有效抑制IL-6促炎細胞因子的分泌。RT-PCR分析結果可得，沒食子提取物也能有效抑制IL-6、STAT3的逆轉錄水平。提示沒食子提取物能有效抑制巨噬細胞功能，減少巨噬細胞致炎細胞因子IL-6等的釋放，阻斷JAK2/ STAT3通路的異常磷酸化，達到抑制炎癥加重的目的。本研究證實沒食子提取物對促炎介質有抑制作用，可通過降低UC大鼠模型血清IL-6、JAK水平及其潰瘍組織IL-6、STAT3基因表達發揮抗UC作用。