止吐六味散對順鉑引起異食癖模型大鼠多巴胺和多巴胺2受體的影響

陳香梅，鮑布日額，新紅，蘇日娜

(內蒙古民族大學蒙醫藥學院，通遼 028000)

蒙藥止吐六味散出自《診治明醫典》，從8世紀至今蒙醫臨床應用，療效確切，為蒙醫止嘔首選良方。方中甘草配以粳米止嘔為君藥，祛巴達干功能的酸梨干為臣，開胃功能的小茴香和芫荽子，調胃火功能的蔓荊子為佐使而形成治療諸嘔吐病的良方[1]。蒙醫臨床上用于泛酸，不思飲食，胃腸道疾病，暈車船，妊娠嘔吐，食物中毒及巴達干熱引起的惡心嘔吐的治療，現今亦用于美尼爾氏綜合征引起的惡心嘔吐，肝膽病引起的嘔吐[2-5]，蒙藥止吐六味散對術后引起的惡心嘔吐療效與雷莫司瓊相當[6]；對化療所致胃腸道毒性反應的治療效果甚好[7]。因此蒙藥止吐六味散具有潛在的進一步開發利用價值。通過前期實驗得出，蒙藥止吐六味散對順鉑引起異食癖實驗大鼠在72 h攝食高嶺土的量明顯減少；蒙醫臨床上對順鉑引起的惡心嘔吐具有一定的抑制作用。筆者以外周及中樞多巴胺(DA)及其D2受體為切入點，研究蒙藥止吐六味散對順鉑引起異食癖大鼠DA合成與代謝、回腸和延髓中D2受體mRNA表達和D2受體蛋白表達的影響，探究止吐六味散治療化療藥誘發引起的惡心嘔吐的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF 級 Wistar 雄性大鼠72只，8周齡，體質量200～230 g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號碼：SCXK(吉)-2016-0003。飼養于國家民委-教育部重點實驗室(內蒙古民族大學動物室)，相對濕度(50%±10%)，溫度(20±3) ℃，攝食飼料量和飲水量不限。

1.2藥品 止吐六味散(由錫盟蒙醫研究所提供，內藥制字M13040163，批號：20160616)。注射用順鉑(齊魯制藥海南有限公司，規格：20 mg，批號：AA2A7003A)；注射用鹽酸昂丹司瓊(江蘇奧賽康藥業有限公司，規格：8 mg，批號：B1612012)。

1.3儀器與試劑 Sunrise型多功能酶標儀(帝肯上海貿易有限公司)；ABI 7500實時熒光定量PCR儀；Fluor Chem HD2化學發光成像系統(美國Protein Simple公司)。大鼠DA酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)試劑盒(批號：E20170601A)，大鼠TH ELISA試劑盒(批號：E20170601A)，二羥基苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)ELISA試劑盒(批號：E20170601A)，延髓單胺氧化酶B(monoamine oxidase B，MAOB)ELISA試劑盒(批號：E20170601A)均購自上海源葉生物科技有限公司。SuperReal熒光定量預混試劑增強版(SYBR Green，批號：Q5705)；Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組，批號：Q6019)；總RNA提取試劑盒(批號：Q5919)均購自天根生化科技有限公司。D2receptor Antibody(批號：13F10)；ECM Kit(兔IgG，批號：12I08A)；Anti-GAPDH Antibody(HRP conjugated，批號：BST17003896)均購自博士德生物工程有限公司。

1.4動物分組與觀測指標 將72只雄性Wistar大鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、模型對照組、昂丹司瓊組和止吐六味散大、中、小劑量組，每組12只，單籠飼養。參照《中藥藥理研究方法學(3版)》大鼠化療性異食癖惡心嘔吐模型的造模方法對各治療組與模型對照組腹腔注射6 mg·kg-1 [8]，空白對照組腹腔注射等容積0.9%氯化鈉溶劑，復制模型成功率達90%以上。造模前1 h(7：00)、造模后 11 h(19：00)給藥。給藥量：昂丹司瓊組1.3 mg·kg-1，止吐六味散小劑量組0.51 g·kg-1、止吐六味散中劑量組1.02 g·kg-1和止吐六味散大劑量組2.04 g·kg-1，正常對照組和模型對照組給等容積0.9%氯化鈉溶液。觀察大鼠每天攝入高嶺土量的變化作為惡心嘔吐的指標。造模72 h后腹腔注射水合氯醛30 mg·kg-1麻醉大鼠，采集回腸和延髓，從腹主動脈取血。采用ELISA 法檢測止吐六味散對異食癖大鼠DA合成及代謝的影響；采用實時熒光定量PCR法和Western blotting法檢測異食癖大鼠回腸和延髓中D2受體mRNA表達和D2受體蛋白表達的影響。

1.5ELISA法檢測DOPAC和DA的含量 運用雙抗夾心ELISA檢測方法測定血清和延髓、回腸組織中DOPAC，DA的含量變化，回腸和延髓MAOB 及酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)水平。嚴格按照說明書標明的方法制備相關試劑，在酶標板上設置標準孔和樣本孔，標準孔加不同濃度相應標準品50 μL(做復孔)，樣品孔中加入待測樣本(血清、回腸勻漿上清液、延髓勻漿上清液)10 μL，再加樣品稀釋液40 μL，空白孔不加。除空白孔外其余每孔加100 μL HRP標記的檢測抗體，用封板膜封板，37 ℃孵育60 min，棄去液體吸水紙上拍干，重復洗板5次，每孔加入底物A，B各50 μL，37 ℃孵育15 min，每孔加50 μL終止液，波長450 nm處測定各孔吸光度(A值)，計算出樣品濃度。

1.6SYBR GreenⅠ Real-time PCR法檢測回腸和延髓組織中D2受體的mRNA表達水平 按照總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒說明書提取總RNA再進行反轉錄反應。引物序列：D2R上游引物5′-CAGTGAACAGGCGGAGAATGG -3′下游引物5′-GAGAGTGAGCTGGTGGTGACT-3′(擴增片長度131 bp)；GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′下游引物5′-TGG TGGTGAAGACGCCAGTAG -3′(擴增片長度153 bp)由賽默飛世爾科技有限公司合成。擴增條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃復性和延伸50 s，40個循環。按照得到溶解曲線和擴增曲線進行結果分析，以GAPDH為內參相對定量D2受體的mRNA表達水平。

1.7Western blotting法檢測大鼠回腸和延髓組織中D2受體的表達 將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入勻漿器中與預先配好的PMSF(最終濃度為1 mmol·L-1)按組織凈重(g)：裂解液(mL)=1：10進行勻漿，冰上孵育1～3 h充分裂解得組織蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書具體步驟操作定量。樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(×2) 按1：1比例混勻100 ℃水浴加熱變性5 min，上40 μg蛋白樣品經10%SDS-PAGE分離轉至PVDF膜上按所需蛋白分子量剪開，10%脫脂奶粉(TBST含0.1%聚山梨酯20)封閉2 h，加入5HT3A多克隆抗體(按1：350稀釋)及兔抗鼠GAPDH(HRP conjugated)單克隆抗體(按1：370稀釋)室溫孵育2 h(搖床)，TBST(含0.1%聚山梨酯20)洗滌3次每次10 min，加入二抗兔IgG(按1：6000稀釋)室溫孵育1 h(搖床)，TBST(含0.1%吐溫20)洗滌3次每次10 min，ECM 顯色劑按1 mL雙蒸水，加顯色劑A，B 各50 μL混勻配制顯色拍照。

2 結果

2.16組大鼠高嶺土攝入量變化比較 適應性飼養1周后開始造模，造模前 72 h每組大鼠每天攝食的高嶺土量差異無統計學意義(P>0.05)；造模后與空白對照組比較，大鼠每天攝食高嶺土的量均明顯增多，說明造模成功。24 h后大鼠攝食高嶺土量的變化最為明顯，模型對照組與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，造模后 48，72 h模型對照組大鼠攝食高嶺土量攝入有所減少，但仍多于空白對照組。昂丹司瓊組、止吐六味散大、中、小劑量組大鼠高嶺土攝入量與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.26組大鼠DA合成和代謝的比較 造模后72 h模型對照組與空白對照組比較，大鼠血清、延髓和回腸DA含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；給止吐六味散72 h后，止吐六味散小劑量組血清、回腸和延髓DA含量比模型對照組明顯降低(P<0.01)，止吐六味散中劑量組、大劑量組血清、回腸和延髓DA含量均顯著降低(P<0.01)。昂丹司瓊組與模型對照組比較大鼠血清、回腸及延髓DA含量差異無統計學意義(P>0.05)。造模后72 h后，模型對照組與空白對照組比較，大鼠血清、回腸和延髓DOPAC含量明顯升高。模型對照組與止吐六味散小劑量組、中劑量組、大劑量組比較，大鼠血清、回腸和延髓DOPAC含量明顯降低(P<0.01)。昂丹司瓊組與模型對照組比較，大鼠血清、回腸及延髓DOPAC含量有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。造模后72 h，模型對照組與空白對照組比較大鼠回腸和延髓 TH 水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；止吐六味散大、中、小劑量組與模型對照組比較，大鼠回腸和延髓TH水平明顯降低(P<0.01)。昂丹司瓊組與模型對照組比較，大鼠回腸及延髓TH水平差異無統計學意義(P>0.05)。造模后72 h，模型對照組與空白對照組比較大鼠回腸和延髓MAOB水平顯著上調(P<0.01)；與止吐六味散大、中、小劑量組比較，大鼠回腸和延髓MAOB水平比模型對照組明顯升高(P<0.05，P<0.01)。而昂丹司瓊組，大鼠回腸及延髓MAOB水平與模型對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，3。

2.36組大鼠回腸和延髓組織D2受體mRNA表達水平的比較 造模后72 h模型對照組與空白對照組比較，大鼠延髓和回腸D2受體mRNA表達水平顯著上調，差異有統計學意義(P<0.01)；給止吐六味散治療72 h后，與模型對照組比較，止吐六味散小劑量組回腸和延髓腸D2受體mRNA表達水平比模型對照組顯著下調(P<0.05或P<0.01)，止吐六味散中劑量組、大劑量組回腸和延髓腸D2受體mRNA表達水平均顯著下調(P<0.01)。昂丹司瓊組與模型對照組比較，大鼠回腸及延髓腸D2受體mRNA表達水平有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.46組大鼠回腸和延髓組織D2受體蛋白表達的比較 造模后72 h后，模型對照組與空白對照組比較，大鼠延髓和回腸D2受體蛋白表達水平顯著上調，差異有統計學意義(P<0.01)。止吐六味散組72 h后，與模型對照組比較，止吐六味散小劑量組回腸和延髓D2受體蛋白表達水平比模型對照組顯著下調(P<0.05或P<0.01)，止吐六味散中劑量組、大劑量組回腸和延髓D2受體蛋白表達水平均顯著下調(P<0.01)。昂丹司瓊組與模型對照組比較，大鼠回腸及延髓D2受體蛋白表達水平明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

表16組大鼠高嶺土攝入量比較

組別造模前72 h造模前48 h造模前24 h造模成功時造模后24 h造模后48 h造模后72 h空白對照組0.38±0.120.25±0.070.22±0.050.25±0.080.38±0.140.25±0.090.38±0.15模型對照組0.39±0.130.27±0.070.25±0.060.18±0.072.89±0.951.91±0.391.64±0.10昂丹司瓊組0.44±0.070.19±0.060.19±0.050.25±0.031.86±0.38?11.41±0.45?10.91±0.27?1止吐六味散 小劑量組0.42±0.100.28±0.050.22±0.040.28±0.042.11±0.22?21.61±0.37?11.02±0.15?1 中劑量組0.41±0.050.28±0.070.19±0.050.31±0.071.60±0.32?11.20±0.43?10.92±0.30?1 大劑量組0.42±0.060.19±0.070.23±0.050.22±0.071.24±0.39?10.96±0.09?10.41±0.10?1

與模型對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

表26組大鼠血清、延髓和回腸DA和DOPAC含量比較

組別DA血清/(ng·mL-1)回腸/(ng·mg-1)延髓/(ng·mg-1)DOPAC血清/(ng·mL-1)回腸/(ng·mg-1)延髓/(ng·mg-1)空白對照組2.47±0.124.94±0.066.36±0.0810.09±0.231.57±0.042.10±0.08模型對照組4.43±0.247.62±0.178.81±0.0913.81±0.162.46±0.173.09±0.11昂丹司瓊組3.85±0.267.03±0.118.32±0.0712.89±0.092.03±0.072.88±0.05止吐六味散 小劑量組3.54±0.22?16.15±0.18?27.41±0.11?212.22±0.22?11.84±0.06?22.79±0.04?1 中劑量組3.02±0.12?25.62±0.20?27.03±0.12?211.22±0.30?21.70±0.05?22.62±0.05?2 大劑量組2.77±0.16?25.44±0.09?26.63±0.06?210.62±0.23?21.61±0.05?22.37±0.06?2

與模型對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

表36組大鼠回腸和延髓TH和MAOB水平比較

Tab.3ComparisonofthelevelsofTHandMAOBinileumsandmedullaoblongatasamongsixgroupsofrats

組別TH回腸延髓MAOB回腸延髓空白對照組40.05±0.79172.64±7.048.02±0.3360.90±1.66模型對照組67.54±3.92266.95±6.075.07±0.4347.00±1.13昂丹司瓊組61.89±1.11246.55±7.135.62±0.5149.46±0.68止吐六味散 小劑量組52.43±1.65?1227.19±8.69?16.63±0.31?153.24±1.46?1 中劑量組49.78±2.10?1204.46±5.96?17.10±0.15?156.09±0.84?1 大劑量組45.68±1.21?1182.42±4.63?17.73±0.31?159.86±1.05?1

與模型對照組比較，*1P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.01

表46組大鼠回腸和延髓組織D2受體mRNA表達水平的比較

Tab.4ComparisonofthemRNAlevelsofD2Rinileumsandmedullaoblongatasamongsixgroupsofrats

組別回腸延髓空白對照組0.89±0.190.84±0.04模型對照組2.74±0.222.55±0.17昂丹司瓊組2.32±0.112.15±0.13止吐六味散 小劑量組1.90±0.25?11.69±0.09?1 中劑量組1.68±0.10?21.46±0.16?2 大劑量組1.28±0.21?21.02±0.33?2

與模型對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

表56組大鼠回腸和延髓組織D2受體蛋白表達的比較

Tab.5ComparisonofD2Rproteinexpressioninileumsandmedullaoblongatasamongsixgroupsofrats

組別回腸延髓空白對照組240.05±38.79192.64±37.04模型對照組767.54±20.92766.95±29.07昂丹司瓊組731.89±29.11716.55±37.13止吐六味散 小劑量組592.43±39.65?1579.19±38.69?1 中劑量組479.78±40.10?2504.46±35.96?2 大劑量組404.68±32.21?2452.42±42.63?2

與模型對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

3 討論

大鼠異食癖模型在國內已經開始廣泛用于化療性嘔吐的相關研究[9-17]。大鼠腦內存在與嘔吐相關的神經通路，大鼠異食癖行為可以作為嘔吐模型，大鼠攝食高嶺土量可以作為惡心嘔吐程度的觀測指標[18-22]。在嘔吐的發生過程中DA為傳統的神經遞質，在嘔吐發生機制研究中常把DA及其相應受體作為嘔吐研究的傳統靶點[23]。影響DA合成與代謝的因素有很多，其中起到關鍵作用的因素為TH和MAOB。TH為DA合成的限速酶，MAOB為主要代謝酶，神經元內的DA 主要由 MAOB 轉化為DOPAC，TH水平升高或降低和MAOB水平上下調節與DA的合成和降解緊密相關[24]。由于昂丹司瓊有效率高于雷莫司瓊且成本低[25]，故在實驗中選用了昂丹司瓊作為陽性對照藥。

實驗結果表明，順鉑造模后72 h大鼠血清、腦延髓和回腸DA含量明顯升高，止吐六味散治療后能夠顯著降低其含量，說明止吐六味散能夠抑制順鉑引起異食癖大鼠DA的合成。DOPAC含量顯著升高表明，TH水平降低和MAOB的升高可證實止吐六味散能夠減少DA的合成，促進DA的代謝；給止吐六味散治療后大鼠回腸和延髓D2受體mRNA表達和D2受體蛋白表達水平均下調，抑制DA與D2受體結合。通過本實驗證實，止吐六味散對順鉑引起大鼠異食癖反應有抑制作用，能夠有效降低異食癖大鼠回腸與延髓 TH含量，提高MAOB含量，抑制 DA 合成、促進DA代謝。其抑制嘔吐可能與下調D2受體mRNA表達和D2受體蛋白表達有關。因此得出蒙藥止吐六味散抑制大鼠異食癖行為與抑制DA的合成及促進DA代謝密切相關。