溫經(jīng)湯中6種水溶性活性成分的含量測定*

路娟，柴瑞平，陳曦

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

溫經(jīng)湯出自《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》，全方由12味中藥組成，分別為吳茱萸、桂枝、當(dāng)歸、川芎、牡丹皮、阿膠、麥門冬、芍藥、人參、甘草、半夏、生姜和甘草[1]。臨床使用歷史悠久，療效明顯，主治婦科原發(fā)性痛經(jīng)等病[2-3]。目前，溫經(jīng)湯的化學(xué)成分分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定筆者還未見報(bào)道，僅有方中部分單味藥材的質(zhì)控研究，這對于中藥復(fù)方新藥的開發(fā)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。尋找快速、準(zhǔn)確、簡便的分析方法對復(fù)方制劑的質(zhì)量控制至關(guān)重要，不僅要提升復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還要符合企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，本次研究擬對涵蓋12味中藥的中藥復(fù)方溫經(jīng)湯的含量測定方法進(jìn)行探索，以期對后續(xù)進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)發(fā)揮指導(dǎo)與參考意義。關(guān)于古方溫經(jīng)湯，桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、吳茱萸堿為2015年版《中華人民人民共和國藥典》中規(guī)定的桂枝、牡丹皮、甘草、吳茱萸指標(biāo)性成分[4-7]，綠原酸及隱綠原酸則是具有多種藥理活性作用的酚酸類化合物[8-10]。本課題組前期已成功建立溫經(jīng)湯高效液相指紋圖譜，基本反映了其整體化學(xué)特征，并對綠原酸等6個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行了指認(rèn)，方法簡單易行，數(shù)據(jù)清晰可信。本研究結(jié)合前期基礎(chǔ)，采用高效液相色譜法同時(shí)測定溫經(jīng)湯中綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿等6種水溶性活性成分的含量，涉及本方多種關(guān)鍵藥味，為其臨床使用的安全性及有效性提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters UPLC H-Class系統(tǒng)(含四元溶劑泵，自動(dòng)進(jìn)樣裝置，在線真空脫氣裝置，PDA檢測器，Empower2色譜工作站)、AB265-S型分析天平(十萬分之一，瑞士METTLER公司)、2-16R臺式高速微量冷凍離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 人參飲片購于吉林敖東健康科技有限公司，生姜購于北京物美超市，其余藥材飲片均購于北京市同仁堂藥店(馬連洼店)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤教授鑒定均為正品，符合2015版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。 綠原酸(批號：170903)、隱綠原酸(批號：171016)、甘草酸銨(批號：170603)，桂皮醛(批號：170328)，丹皮酚(批號：170421)及吳茱萸堿(批號：170524)均購自于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。乙腈(Merck公司，色譜純)、甲酸(汕頭市西隴化工廠有限公司，分析純)、屈臣氏雙蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1溫經(jīng)湯水煎液及供試品溶液的制備 參考《名方配伍分析及應(yīng)用》(人民衛(wèi)生出版社)收錄，按一兩=3 g計(jì)算，取吳茱萸9 g，當(dāng)歸6 g，川芎6 g，人參6 g，桂枝6 g，阿膠6 g，生姜6 g，牡丹皮6 g，甘草6 g，半夏6 g，麥冬9 g，加水10倍量，浸泡30 min，加熱回流提取2次，每次1 h，合并兩次濾液，搖勻后水浴濃縮至750 mL，取適量濾液，4 ℃，12 000 r·min-1離心(r=6 cm)10 min，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液，置于進(jìn)樣小瓶中待測，剩余樣品密封后保存于-20 ℃環(huán)境中[11]。同法平行制備溫經(jīng)湯水煎液10批，編號S 1～S 10，供測試用，同時(shí)留樣保存于實(shí)驗(yàn)室冰箱。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿對照品分別置于5 mL量瓶中，加入純甲醇制備單一對照品母液；精密吸取單一對照品母液適量，置于同一量瓶中，加入純甲醇定容搖勻，配制得到含有綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿濃度分別為150.08，150.36，344.08，16.83，51.06，40.74 μg·mL-1的混合對照品溶液(其中：甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.0207)。

2.3陰性對照溶液的制備 按照“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法分別制備缺吳茱萸、缺甘草、缺桂枝、缺牡丹皮的陰性樣品及缺吳茱萸、甘草、桂枝、牡丹皮的陰性樣品溶液，處理方法不變。

2.4色譜條件 Waters Xselect HSS T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～25 min，5%～22% A，25～35 min，22%～30% A，35～45 min，30%～60% A，45～60 min，60%～80% A)，平衡色譜柱15 min，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長分別為：綠原酸327 nm、隱綠原酸327 nm、甘草酸(銨)237 nm、桂皮醛290 nm、丹皮酚274 nm、吳茱萸堿225 nm。分別精密吸取混合對照品溶液、供試品和陰性對照溶液各10 μL，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖。樣品中綠原酸等6種水溶性成分的色譜峰達(dá)到較為理想的分離效果，且陰性對照無干擾。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.5線性關(guān)系考察 將“2.2”項(xiàng)得到的混合對照品溶液梯度稀釋為一系列不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿對照品回歸方程、峰面積與濃度相關(guān)系數(shù)(r)及線性濃度范圍見表1。結(jié)果顯示，各個(gè)成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取S1批溫經(jīng)湯樣品 5份，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，測得綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿各成分峰面積的RSD分別為0.44%，0.56%，0.32%，0.51%，1.02%，0.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測定，測得綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿各成分峰面積的RSD分別為0.31%，0.15%，0.22%，0.60%，0.18%，0.77%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一溫經(jīng)湯樣品溶液，在室溫下放置，分別于0，2，4，8，12，24 h按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，測得綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿各成分峰面積的RSD分別為0.35%，0.29%，0.30%，0.48%，0.35%，1.11%，表明樣品溶液中6種水溶性成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿含量的溫經(jīng)湯樣品6份，每份2.5 mL，精密加入綠原酸、隱綠原酸、甘草酸銨(其中：甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨重量/1.0207)、桂皮醛、丹皮酚、吳茱萸堿對照品適量，制得供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2，表明該方法準(zhǔn)確度良好，符合技術(shù)要求。

A.混合對照品； B.溫經(jīng)湯水煎液；C.缺甘草陰性樣品溶液；D.缺牡丹皮陰性樣品溶液；E.缺吳茱萸陰性樣品溶液；F.缺桂枝陰性樣品溶液；G.同時(shí)缺以上4味藥材的陰性樣品溶液；1.綠原酸；2.隱綠原酸；3.甘草酸銨；4.桂皮醛；5.丹皮酚；6.吳茱萸堿

圖1254nm波長下溫經(jīng)湯HPLC色譜圖

A.mixed reference substances； B.Wenjingdecoction； C.negative sample withoutGlycyrrhizaeRadix；D.negative sample withoutMoutanCortex； E.negative sample withoutEvodiaeFructus；F.negative sample withoutCinnamomiRamulus；G. Negative sample withoutGlycyrrhizaeRadix，MoutanCortex，EvodiaeFructusandCinnamomiRamulus；1.chlorogenic acid；2.cryptochlorogenic acid；3.glycyrrhizic acid；4.cinnamaldehyde；5.paeonol；6.evodiamine

Fig.1HPLCchromatogramofWenjingdecoctionat254nm

表1溫經(jīng)湯6種水溶性成分回歸方程、峰面積與濃度相關(guān)系數(shù)及線性范圍

Tab.1Regressionequation,correlationcoefficientofpeakareaandconcentration,andlinearrangeofsixwater-solubleactiveingredientsfromWenjingdecoction

成分回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)綠原酸Y=36 951X-56 0420.999 930.02～150.08隱綠原酸Y=33 891X-63 8140.999 830.07～150.36甘草酸銨Y=6 095.4X-31 7140.999 668.82～344.08桂皮醛Y=127 235X-70 3420.999 910.10～50.50丹皮酚Y=64 516X-72 0630.999 510.21～51.06吳茱萸堿Y=27 244X-4 7070.999 510.18～50.90

表2溫經(jīng)湯6種水溶性成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)

Tab.2Recoveryofsixwater-solubleactiveingredientsfromWenjingdecoctionn=6

成分原有量加入量測得量mg平均回收率RSD%綠原酸0.130.150.2999.981.04隱綠原酸0.130.150.28100.511.23甘草酸0.650.691.34100.070.75桂皮醛0.040.050.10103.111.31丹皮酚0.060.060.1297.891.74吳茱萸堿0.030.030.0698.062.11

2.10樣品含量測定 取溫經(jīng)湯樣品溶液平行5份，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，將測得的峰面積分別代入“2.5”項(xiàng)下的回歸方程，計(jì)算樣品中綠原酸、隱綠原酸、甘草酸、桂皮醛、丹皮酚和吳茱萸堿的含量，(其中：甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。見表3。

表3溫經(jīng)湯6種水溶性成分的含量

Tab.3Contentsofsixwater-solubleactiveingredientsfromWenjingdecoctionn=5

成分含量平均值/(mg·g-1)RSD/%綠原酸0.540.56隱綠原酸0.540.61甘草酸2.631.12桂皮醛0.140.52丹皮酚0.252.10吳茱萸堿0.091.88

3 討論

本研究根據(jù)課題組前期建立的溫經(jīng)湯高效液相指紋圖譜為參考，采用全波長掃描的方法對樣品及對照品在210～400 nm下進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸、隱綠原酸在327 nm處有最大吸收，甘草酸銨在237 nm處有最大吸收，桂皮醛在290 nm處有最大吸收，丹皮酚在274 nm處有最大吸收，吳茱萸堿在225 nm處有最大吸收，因此分別在各個(gè)成分最大吸收波長下進(jìn)行含量測定。

筆者考察了不同規(guī)格的色譜柱對成分分離的影響，分別為Waters XBridge Shield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters XBridge BEH Amide(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Waters Xselect HSS T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用Waters Xselect HSS T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)時(shí)峰形對稱，分離度符合要求[12]；通過考察常用流動(dòng)相甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等條件[13-14]，其中乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)供試品溶液色譜峰分離度等指標(biāo)均優(yōu)于其他，最終確定其為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方法對供試品進(jìn)行分析。古代經(jīng)典名方是中藥新藥開發(fā)重要寶庫，挖掘前人寶貴經(jīng)驗(yàn)，全面開發(fā)中藥新藥，提升質(zhì)量與療效的工作刻不容緩。本研究建立了HPLC法同時(shí)測定溫經(jīng)湯中6種水溶性成分含量測定的方法，該方法簡單易行、準(zhǔn)確真實(shí)，穩(wěn)定可靠，為古代經(jīng)典名方開發(fā)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考[15-17]。