基于超高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質譜的人血白蛋白未知蛋白分析

郭江紅，柯兵兵，胡遠華，王文晞，姜紅

(湖北省藥品監督檢驗研究院，武漢 430075)

人血白蛋白是血漿中含量最高的蛋白質，等電點為5.9，相對分子量為69 000，為一級結構較為簡單的單鏈結構蛋白。在血液制劑系列產品中，人血白蛋白是血液制品中的主要產品，屬于血容量擴充劑，臨床上主要用于失血、燒傷、水腫等低蛋白血癥[1]。人血白蛋白是最早從人血漿中提取并大規模生產應用的血液制品[2]。然而，隨著白蛋白的臨床用量日益上升，不良反應的報道逐漸增多。不良反應除與臨床輸注技巧及個體差異相關外，主要與白蛋白中存在的聚合物相關。制劑中的聚合物達到一定量時，可促使機體發生免疫應答，產生變態反應；有報道顯示人血白蛋白中自身聚合物的產生可能是因為產品中白蛋白的濃度較高，離體條件下容易形成聚合體。另外，人血白蛋白工藝中均采用巴氏消毒法(60 ℃，10 h)滅活病毒，產品中殘留的未知雜蛋白對熱不穩定，在滅活工藝中易變性與白蛋白形成聚合體。因此探究白蛋白制品中的未知蛋白可為臨床不良反應提供參考[3]。人血白蛋白是上市多年的傳統產品，學者對該類品種的臨床適應癥關注較多，對其中的未知蛋白的關注較少，目前筆者尚未見國內外對人血白蛋白進行系統的蛋白質組分的研究報道。本研究通過對聚合體的分離收集，并對其中未知蛋白進行質譜鑒定，建立人血白蛋白未知蛋白譜，結合各個企業的生產工藝參數，為提升人血白蛋白生產工藝提供參考。

1 儀器與試藥

1.1主要儀器 AKTA Pure25蛋白純化儀(美國GE公司)；G2 Q-ToF LC/MS 液質聯用色譜儀(美國Waters公司)；Waters蛋白組學服務器(ProteinLynx Global SERVERTMPLGS)；5804R高速冷凍臺式離心機(德國eppendorf 公司)；Hiprep 16/60 Sepharyl S-200 HR凝膠過濾色譜柱；ACQUITY UPLC BEH130 C18(2.1×100 mmol·L-1，1.7 μm)色譜柱；超濾管(德國Sartorius 公司，截留Mr 10000)。

1.2試藥 Trypsin (Sigma公司，批號：SLBG6452V)，二硫蘇糖醇(DTT，DLAEL-SM，東京化成)，碘乙酰胺(IAA，Sigma公司，批號：SLBD7510V)，甲酸(Sigma公司，批號：SZBE3390V)，乙腈(Merck公司，色譜級，批號：JA045030)。尿素(批號：20160711)、鹽酸(批號：20150413)、磷酸二氫鈉(批號：20140922)、磷酸氫二鈉(批號：20161114)、異丙醇(批號：20160624)均為國藥集團化學試劑有限公司產品。15批人血白蛋白樣品分別為5家企業生產產品(A企業，批號：20160607，20160709，20160711；B企業，批號：201604010，201605016，201606020；C企業，批號：20160205，20160309，20160410；D企業，批號：20160204，20160307，20160409；E企業，批號：201603004，201604012，201605018)。

2 方法與結果

2.1凝膠色譜層析分離 采用AKTA Pure25蛋白純化儀，Hiprep16/60SepharylS-200HR凝膠色譜柱；流動相為磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉溶液(0.5 mol·L-1磷酸二氫鈉 200 mL，0.5 mol·L-1磷酸氫二鈉 420 mL，異丙醇15.5 mL，純水914.5 mL，調節pH值6.98)，柱溫25 ℃，流速0.5 mL·min-1；檢測波長 280 nm。供試品溶液濃度25 mg·mL-1，進樣量1 mL。在上述的色譜條件下，以5家企業白蛋白制劑作為供試品，供試品溶液色譜圖見圖1。結果顯示在白蛋白主峰前有兩個大分子峰，按《中華人民共和國藥典》2015年版通則3121人血白蛋白多聚體測定法標準圖譜，兩個峰分別為多聚體與二聚體。重復進行3次試驗，均得到基本相同的色譜圖。

圖1 SEC法分離人血白蛋白典型色譜圖

Fig.1TypicalchromatogramofhumanserumalbuminseparatedbySECmethod

2.2大分子蛋白組分的收集與濃縮 在上述色譜條件下，分別收集分離峰1和分離峰2的流分，每批樣品重復進樣2次，置超濾管中，離心5次(4000×g，5 min)，以除去樣品中殘留的鹽，最后濃縮至1 mL，于4 ℃保存備用。

2.3胰蛋白酶酶解 量取濃縮除鹽后的樣品溶液各100 μL，分別加胰蛋白酶酶解溶液300 μL(6 mol·L-1尿素、50 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8)，5 mmol·L-1DTT)，37 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，加入碘乙酰胺至終濃度為15 mmol·L-1，室溫避光30 min，加入3倍體積的50 mmol·L-1Tris-HCl，37 ℃孵育過夜，12 000×g離心30 min，取上清液，備用。

2.4UPLC-ESI-Q-TOF分析

2.4.1UPLC色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH130 C18(2.1×100 mmol·L-1，1.7 μm)；流動相：水(含0.1%甲酸)(A)，乙腈(B)；進樣量為2 μL，檢測波長為280 nm。梯度洗脫程序見表1。

2.4.2ESI-Q-TOF質譜條件 正離子模式，脫溶劑氣流速800 L·h-1，脫溶劑溫度400 ℃，源電壓2000 V，掃描方式為全掃描二級質譜(full scan)，采集模式為MSE，采集范圍100～2500 m·z-1。見圖2，3。

2.5數據分析 將采集的數據用Protein Lynx Global Server3.0軟件進行數據庫搜索，從uniprot蛋白數據庫中下載Human Plasma，進行搜庫鑒定。搜庫參數為：

表1 梯度洗脫程序

圖2 胰蛋白酶酶切總離子流圖

Fig.2Chromatogramoftotalionflowsamplesdigestedwithtrypsin

圖3 一級質譜圖

人血漿蛋白數據庫；蛋白酶：胰蛋白酶；蛋白質相對分子質量范圍：10～150 000；漏切位點數為1，可變修飾：氧化(甲硫氨酸)。軟件會以打分的形式評判鑒定結果的可信度，為了保證鑒定結果的可靠性，數據分析時優先考慮蛋白質中匹配的肽段個數，隨后考慮連續b/y離子以及氨基酸序列的覆蓋率，綜合分析將鑒定閾值分數設為150。

2.6方法的重復性 取1批樣品(C企業，批號：20160309)作為重復性考察的樣品，按照上述擬定的方法重復實驗。結果顯示：3次實驗分別鑒定到10，10，8種蛋白，其中共有蛋白有8個，說明該方法重復性良好。

2.7未知蛋白質譜鑒定結果 本研究共收集5家企業各3批次，共15批次人血白蛋白樣品，按照擬定的方法鑒定產品中未知蛋白，匯總結果見表2。峰1共鑒定出21種未知蛋白，峰2共鑒定出8種未知蛋白。15批次產品中鑒定出5個共有未知蛋白，分別為血色素結合蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A-II、a-1B 糖蛋白、a-2-HS 糖蛋白。5家企業產品共鑒定出21種未知蛋白，A企業產品未知蛋白種類最少，僅有7種。B企業、C企業與D企業的未知蛋白種類數分別為10種、10種與12種。E企業產品未知蛋白種類最多，有19種(表2)。以人血紅素結合蛋白為例，蛋白質多肽EVGTPHGIILDSVDAAFICPGSSR匹配示意圖見圖4。

3 討論

目前，國內企業及大部分國外企業均采用低溫乙醇沉淀法生產人血白蛋白，其分離血漿蛋白的主要原理是：向蛋白質的水溶液中加入乙醇，從而降低水分子的活動，降低溶液的介電常數，排斥蛋白質周圍的水分子，使蛋白分子之間通過極性基團的相互作用在范德華引力下發生凝集，從而沉淀下來[4-5]。影響這種沉淀過程的主要有5大參數：溶液的蛋白濃度、pH值、離子強度、溫度與乙醇濃度。通過不同的參數組合，可以將不同的血漿蛋白分離出來。目前國內企業采用基本相同的工藝路線，但各企業具體工藝參數、步驟及控制水平有差異。產品中未知雜蛋白的種類及數量能有效反映工藝的差異，因此，建立產品中未知雜蛋白的檢測鑒定方法能夠比較不同企業工藝水平與產品的內在質量。筆者主要建立了未知蛋白分離、酶解及質譜鑒定的方法。在研究過程中，對蛋白分離方法與蛋白酶的選擇均進行了比較分析。在未知雜蛋白的分離中，最初選擇陰離子交換色譜柱進行分離，但分離效果較差，只有白蛋白單一主峰，無法獲得白蛋白峰以外的雜蛋白峰。可能因為人血白蛋白生產工藝利用蛋白質的等電點性質進行分離，殘留的未知雜蛋白與白蛋白的等電點差異不大，導致陰離子交換色譜柱無法有效分離[6]。對鑒定出21種雜蛋白等電點進行分析，等電點主要集中于pH值5.3～7.3之間，與人血白蛋白等電點(5.9)接近。在酶解過程中比較了胃蛋白酶與胰蛋白酶酶切效果，采用胃蛋白酶進行水解后，在進行質譜檢測，其總離子流圖結果顯示胃蛋白酶未能將蛋白質完全消化為肽段，且質譜鑒定出的未知蛋白種類數較少，可信度不高，重復性較差；胃蛋白酶的酶切位點為苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等疏水氨基酸，是一種比較溫和的蛋白酶，特異性并不明顯；而胰蛋白酶的酶切位點為精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸特異性較高，肽圖顯示其酶解較為完全，質譜鑒定出的未知蛋白可信度較高，且重復性較好，因此最后選擇胰蛋白酶進行水解。

《中華人民共和國藥典》2015年版中也采用分子排阻法測定人血白蛋白多聚體含量，按照通則3121的標準圖譜[7]，圖1中峰1、2應分別為白蛋白多聚體與二聚體，但質譜鑒定結果顯示：峰1與峰2中均鑒定出白蛋白與其他血漿蛋白，且這些血漿蛋白大部分相對分子量分布在11 000～62 000，結果提示可能相對分子質量較小的未知蛋白以及白蛋白通過相互作用，形成分子量較大的聚合物或聚合體。以觸珠蛋白為例，在質譜鑒定結果中以其β-鏈(40 000)的形式顯示，然而在生理條件下，觸珠蛋白是以四聚體(α1β)2的形式存在于血液中，完整分子量大于白蛋白[8]；而且在體內，觸珠蛋白與血紅蛋白相互作用，參與到血漿游離血紅蛋白清除的過程，因此它與血紅蛋白有較高的親和力，兩者殘留在產品中容易形成分子量較大的復合物或多聚體[9]；而且由于人血白蛋白對熱比較穩定，生產工藝中均采用巴氏病毒滅活(60 ℃，10 h)，這些熱不穩定的雜蛋白在滅活工藝時容易變性，捕獲白蛋白單體共價形成聚合體[10]；因此，《中華人民共和國藥典》2015年版人血白蛋白多聚體含量項下所測得多聚體與二聚體不僅是白蛋白聚合體，也包含其他雜蛋白。

筆者通過本研究，初步建立了人血白蛋白中未知蛋白的檢測方法，得到不同企業產品中未知蛋白種類，為白蛋白質量控制和評價提供了重要的數據支撐；所鑒定的未知蛋白質種類，能夠為臨床用藥安全提供重要的信息支持。同時，也對蛋白質種類與工藝控制的相關性作了初步的探索，為人血白蛋白工藝的優化提升奠定了基礎。

表2 5家企業未知蛋白鑒定結果

圖4 人血紅素結合蛋白多肽EVGTPHGIILDSVDAAFICPGSSR匹配示意圖