3種中藥成分對CYP2C9酶的影響*

范宰文，馬思琪，徐愛軍，王亞蒂

(華北理工大學基礎醫學院，唐山 063000)

隨著中藥現代化的發展，目前已有許多中草藥進入了歐美市場，并且占了大量的市場份額，但同時也有許多報道指出中草藥之間、中草藥與化學藥合并使用時可能存在危害性[1-3]。中草藥有效成分在體內代謝酶作用下發生代謝轉化的同時對酶也會產生抑制或誘導作用，引起合用藥物藥代行為的改變，產生代謝性相互作用。細胞色素P450(CYP)酶被抑制或誘導是引起代謝性藥物相互作用并導致藥物不良反應增加或療效降低的重要原因[4]。CYP酶是最重要的一類藥物代謝酶，參與75%臨床藥物的代謝，對CYP 酶的抑制或誘導是引起藥-藥代謝性相互作用的重要因素[2-3]。中藥有效成分對CYP 酶的抑制能降低合用的其他中藥成分或化學藥物的體內代謝消除，打破合用藥物與其代謝產物之間的平衡，升高血藥濃度或引起蓄積，導致藥物的藥效增強乃至不良反應或毒性反應的發生[5-6]。因此，評價中藥有效成分對CYP 酶的抑制活性，對于臨床安全用藥、降低藥-藥相互作用的風險有重要的意義。現有的文獻報道以CYP3A4的研究最為多見；然而，CYP2C9亦為體內主要的藥物代謝酶之一，特別是在抗凝藥物華法林和抗癌藥物紫杉醇等許多臨床常用藥的代謝中被廣泛研究，具有重要地位[2-3]。含槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸等成分的中藥在抗凝、抗癌或增強機體免疫力方面均有廣泛應用，因此臨床上極有可能發生藥-藥相互作用。鑒于此，筆者以CYP2C9酶為研究對象，應用探針底物法，選擇3種中藥成分槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸，采用大鼠肝微粒體模型，以甲苯磺丁脲(tolbutamide,TB)為探藥，通過檢測TB甲基羥基化的反應產物確定CYP2C9酶的活性，在體外評價了大鼠肝微粒體中3種常見中藥有效成分對CYP2C9酶的抑制活性，為深入理解這些中藥有效成分的代謝性質并闡明它們的藥-藥相互作用機制、避免不良的藥物相互作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1主要儀器 Waters 高效液相色譜儀、515泵、2487紫外檢測器、Empower色譜數據工作站，均為美國Waters公司；Beckman Allegra-64R型低溫高速離心機(美國Beckman公司)；TU-1901紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；PRO 200勻漿器(美國PRO Scientific公司)；華普達SHA-C水浴恒溫振蕩器(常州市華普達教學儀器有限公司)；電熱恒溫水浴箱(上海醫療儀器五廠)；ZH-2渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)；梅特勒AE240電子分析天平(瑞士，感量：0.01 mg)；SANYO -80℃低溫冰箱(日本)；BK-360B 超聲波脫氣機[濟南巴克超聲波科技(集團)有限公司]；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；色譜柱：Symmetry C8柱(美國Waters，150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-醋酸銨緩沖液(pH值=5.25，1 mmol·L-1)，30：70；流速：1.0 mL min-1；柱溫：30 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：230 nm。

1.2藥品 槲皮素(批號：100081-200907)、芍藥苷(批號：110736-201035)和齊墩果酸(批號：110709-200505)標準品均購自中國食品藥品檢定研究院；TB對照品(SIGMA-ALDRICH Co批號：080M1713V)；氯磺丙脲對照品(東京化成工業株式會社,批號：G101-RMFF)；羥基甲苯磺丁脲(hydroxytoluene sulfobutamide,HS)對照品(SPI bio Bertin Co，批號：M02009)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷輔酶Ⅱ(NADP+)；葡萄糖六磷酸(G-6-P)；葡萄糖六磷酸脫氫酶(G-6-PDH)分別購自Roche公司。

1.3動物 健康Wistar大鼠5只，雄性，體質量為180～220 g，SPF級，由華北理工大學實驗動物中心提供，合格證號：1512125。許可證號：SYXK(京)2014-0004，在恒溫(24±2)℃、光照周期12 h：12 h環境中飼養1周后實驗。

1.4探針和陽性抑制劑儲備液及工作液的制備 TB儲備液和工作液(10 mmol·L-1)：取TB標準品約0.10 g，精密稱定，置5 mL棕色量瓶中，加乙腈：水(1：1)溶解，并定容至刻度，制得80 mmol·L-1的TB儲備液，另以乙腈：水(1：1)稀釋得10 mmol·L-1的TB工作液，均置于4 ℃冰箱避光保存；HS儲備液：精密稱取HS標準品約2.5 mg，置10 mL容量瓶中，加乙腈：水(1：1)至刻度，溶解，即得250 μg·mL-1HS儲備液，-20 ℃冰箱保存；磺胺苯吡唑工作液：取磺胺苯吡唑標準品約1.25 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇：水(1：1)定容，制成0.4 mmol·L-1的磺胺苯吡唑工作液，4 ℃冰箱避光保存；內標工作液(IS)：取氯磺丙脲標準品約10.0 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加純乙腈至刻度，溶解，即得1 mg·mL-1工作液，4 ℃冰箱避光保存。分別精密稱取槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸標準品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成5 mmol·L-1的3種中藥有效成分工作液。

1.5肝微粒體的制備 取大鼠正常肝組織，用4 ℃ 0.15 mol·L-1氯化鉀磷酸鹽緩沖液反復沖洗，除凈血污，稱取肝臟組織剪成碎塊，按1：4(W/V)比例加入上述0.15 mol·L-1氯化鉀磷酸鹽緩沖液，勻漿器制成肝勻漿。將制備好的勻漿在離心機上以5000 r·min-1(r=12.7 cm)的速度離心10 min，取上清液再以15 000 r·min-1(r=12.7 cm)的速度離心20 min，取上清液，最后以60 000 r·min-1(r=12.7cm)的速度離心60 min，棄去上清液，得粉紅色沉淀(即肝微粒體)，將其懸浮于20%甘油磷酸鹽緩沖液中，分裝后放入-80 ℃冰箱中儲存備用。以上所有操作均在冰浴中進行。

1.6TB與肝微粒體的體外反應及HPLC法測定 孵育體系總體積100 μL，包含微粒體蛋白、0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值=7.4)，TB、5 mmol·L-1MgCl25 μL、10 mmol·L-1G-6-P 5 μL、1.5 mmol·L-1NADP+5 μL，置于10 mL具塞離心管中，37 ℃水浴預孵育3 min，加入葡萄糖六磷酸脫氫酶(1.38 U·mol-1)2 μL啟動反應，30 min后加1 mol·L-1冰醋酸10 μL，終止反應，同時加入內標工作液5 μL，渦旋振蕩30 s，加入提取液異丙醚2.5 mL，渦旋3 min，4000 r·min-1離心10 min，取上層有機相2 mL于另一試管中，在40 ℃時用氮吹儀吹干，用200 μL流動相復溶，渦旋3 min，10 000 r·min-1(r=12.7 cm)離心10 min，取50 μL進樣進行HPLC色譜分析，每個濃度平行重復3次。

1.7磺胺苯吡唑抑制作用的研究 孵育體系總體積100 μL，含大鼠正常肝微粒體蛋白0.5 mg·mL-1，終濃度為1.2 mmol·L-1的TB，磺胺苯吡唑工作液(終濃度為10，5，2.5，1.3，0.625，0.325，0.15 625，0.08 125 μmol·L-1)，以下操作同“1.6”項，每個濃度平行重復3次。

1.8槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸對大鼠肝微粒體的抑制作用 以各中藥有效成分置換孵育體系中的陽性抑制劑磺胺苯吡唑，各有效成分的系列濃度均為0. 25，0. 5，1，2. 5，5，10，50 和100 μmol·L-1，按上述”1.7”項下程序進行孵育，由不同濃度反應組底物代謝產物的生成率計算酶抑制率及半數抑制濃度(IC50)值[7]。

2 結果

2.1TB在大鼠肝微粒中的代謝及HPLC測定 不同濃度的TB分別與大鼠肝微粒體溫孵30 min ，色譜圖見圖1 。由圖1可見，TB與空白肝微粒體溫孵液中的雜質峰及TB代謝物HS峰達到良好分離。HS的保留時間為3.8 min，內標的保留時間為7.8 min，TB的保留時間為19.2 min。在此色譜條件下，內標物氯磺丙脲和底物TB及其代謝產物HS均分離完全，沒有干擾。HS的精密度的RSD<5%，最低檢測限為0.125 μg·mL-1，在0.125～16 μg·mL-1之間線性關系良好；且HS的檢測準確度較高，說明此方法具有良好的精密度和準確度。

2.2CYP2C9酶陽性抑制劑磺胺苯吡唑的酶抑制作用 CYP2C9酶陽性抑制劑磺胺苯吡唑在大鼠肝微粒體體系中均能明顯地抑制CYP2C9酶介導的TB甲基羥基化反應，得到的抑制曲線呈S型特征，將濃度取對數后與抑制率(inhibition rate，IR)進行回歸分析，得大鼠回歸方程為Y=2.999 5X-1.752 7(34.52≤X≤75.02，R2=0.934 3)，見圖2，計算IC50值為0.584 4 μmol·L-1，詳見表1，該結果基本與文獻報道的0.24～0.96 μmol·L-1一致[6]。

2.3槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸3種中藥成分對CYP2C9的抑制作用 槲皮素、芍藥苷、齊墩果酸在大鼠肝微粒體中的IC50值比較，如表1 所示。研究表明，3種中藥成分對CYP2C9均有一定的抑制作用。以磺胺苯吡唑為陽性對照，分別計算3種中藥成分的抑制率結果：槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸抑制率見圖3～5，3種中藥活性成分的抑制曲線呈典型的S型。槲皮素、齊墩果酸和芍藥苷的IC50分別為15.343，49.361和4.115 μmol·L-1。按照通用的CYP 酶抑制劑強度分級規則[8]，IC50<1 μmol·L-1為強抑制劑，1 μmol·L-110 μmol·L-1為弱抑制劑。由圖3～5可見，槲皮素、芍藥苷、齊墩果酸對CYP2C9均有抑制作用，以齊墩果酸的抑制作用最強，而芍藥苷的抑制作用不明顯。

3 討論

筆者采用差速離心法制備大鼠肝微粒體，在體外模擬CYP2C9酶對TB代謝的實驗并進行研究。以TB為探針，以CYP2C9酶的經典抑制劑磺胺苯吡唑為陽性對照，在體外模擬3種中藥成分對CYP2C9酶的抑制作用。磺胺苯吡唑的抑制作用明顯，所得IC50的值與文獻所述基本一致(表1)。實驗結果顯示，隨著時間的延長，產物量逐漸增加。但是5 min的孵育時間太短，不易操作，且代謝產物量較少，誤差較大。隨著時間的延長，產物增長率降低，導致代謝產物生成量與孵育時間不成比例增加，且30 min足夠進行不同濃度抑制劑的比較，操作容易，故選擇30 min的孵育時間。

中藥有效成分對CYP 酶的抑制作用是引起代謝性藥-藥相互作用的重要因素之一[9]。中藥多組分和多靶點的特性決定其相互作用機制的復雜性，對主要有效成分的酶抑制活性評價可以為深入認識中藥合理配伍應用及其機制提供科學依據。有文獻報道，銀杏葉提取物中槲皮素對CYP2C9、CYP3A4有顯著抑制作用[7]，穗花杉雙黃酮對CYP2C9有抑制作用[10]，而白果內酯則通過誘導CYP2C加速S-華法林的代謝[11]。

A.肝微粒體空白對照圖譜；B.肝微粒體加入內標氯磺丙脲(IS 0.05 mg·mL-1)圖譜；C.肝微粒體代謝TB的圖譜(TB 1.2 mmol·L-1)

圖1大鼠肝微粒體代謝甲苯磺丁脲HPLC檢測圖譜

A.chromatography of blank control of liver microsome；B.chromatography of liver microsome spiked with chlorpropamide (IS,0.05 mg·mL-1)；C.chromatography of TB (1.2 mmol·L-1)metablized by liver microsome

Fig.1HPLCchromatographyoftolbutamidemetabolizedbylivermicrosomeofrats

圖2磺胺苯吡唑對大鼠肝微粒體CYP2C9的抑制作用

Fig.2InhibitionofsulfaphenazoleonratCYP2C9inlivermicrosome

表1磺胺苯吡唑和3種中藥成分對CYP2C9的IC50值

Tab.1IC50valuesofsulfaphenazoleandthreeherbalconstituentsonCYP2C9μmol·L-1

特殊抑制劑/成分IC50參考范圍磺胺苯吡唑0.584 4±0.083 40.24～0.96槲皮素15.340 0±2.191 0-芍藥苷49.360 0±7.051 0-齊墩果酸4.115 0±0.593 5-

圖3槲皮素對大鼠肝微粒體CYP2C9的抑制曲線圖

Fig.3InhibitarycurveofquercetinonratCYP2C9inlivermicrosome

圖4芍藥苷對大鼠肝微粒體CYP2C9的抑制曲線圖

Fig.4InhibitarycurveofpaeoniflorinonratCYP2C9inlivermicrosome

圖5齊墩果酸對大鼠肝微粒體CYP2C9的抑制曲線圖

Fig.5InhibitarycurveofoleanolicacidonratCYP2C9inlivermicrosome

筆者采用不同濃度的中藥有效成分，在大鼠肝微粒體中與探針底物共同溫孵，通過計算IC50值對3種中藥有效成分的酶抑制活性進行初步分級；結果顯示：槲皮素、芍藥苷和齊墩果酸3種有效成分對CYP2C9酶活性的抑制有較大差別，其中齊墩果酸對CYP2C9的抑制率大于70%； 芍藥苷的抑制作用較弱。應用IC50值對3種中藥有效成分的酶抑制活性進行初步分級，結合這些有效成分的體內血藥濃度可以為臨床藥-藥相互作用的預測提供參考。但是，這些有效成分在人體的酶抑制活性及機制還有待于在體內試驗進一步研究。當臨床上使用含齊墩果酸成分的中藥及其制劑時，應盡量避免與經CYP2C9代謝的藥物聯合應用，如：氟伐他汀、氯吡格雷、厄貝沙坦、氯沙坦、華法林、替諾昔康、氯諾昔康、托拉塞米、格列美脲、格列吡嗪、雙氯芬酸、布洛芬。如根據臨床需要必須聯合應用時，應關注CYP2C9介導的代謝性藥物相互作用，特別是與治療窗窄的藥物聯合應用時，避免由于齊墩果酸對CYP2C9的抑制作用，使聯用藥物的血藥濃度增高，導致不良反應增加而產生不良后果，提高臨床用藥的安全性和有效性。