基于HPLC指紋圖譜的當歸不同干燥品質量研究△

李旭，李成義*，陳杰，焦彥斌，強正澤，李波，王明偉

1.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅天士力中天藥業有限責任公司，甘肅 定西 748100

當歸來源于傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，始載于《神農本草經》。味甘、辛，性溫。具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功效[1]。當歸所含化學成分復雜多樣，主要涉及揮發油、有機酸、多糖和黃酮等成分[2-6]。現行的當歸質量標準由辨別真偽優劣的定性指標(如采收期、產地、性狀等)和定量指標(如水分、揮發油、阿魏酸含量等)組成，控制的是當歸某部分組分，忽略了多組分的協同作用。中藥指紋圖譜基于對中藥物質群整體作用的認識，具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性等特點，與中醫整體觀相適應，成為中藥的“化學條碼”，是實現鑒別中藥真偽優劣的可行模式[7-9]。

中藥材產地加工是中藥材生產和品質形成必不可少的重要環節，這一環節的實現使藥材質量得以保證，且便于貯存、運輸[10-11]。傳統干燥加工方法簡單易行，但往往干燥周期長、費時費力，無標準可循，導致加工中藥材品質參差不齊。現代干燥加工方法的涌現，為中藥材干燥加工增添了新的內容。本實驗采用HPLC指紋圖譜技術，建立了當歸HPLC指紋圖譜，通過相似度評價、主成分分析和聚類分析對當歸不同干燥品進行了分析，以期為評價當歸干燥方法提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，FW177型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，CAV214C型電子天平(美國奧豪斯公司)，BT25S型1/100 000電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，Milli-Q Century超純水機(德國默克公司)。

1.2 材料

對照品阿魏酸、綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110753-201718，110753-201718)；洋川芎內酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內酯(北京北納創聯生物技術研究院，批號分別為62006-39-7，6066-49-5，4431-01-0)；乙腈為色譜純；其余為分析純。

當歸新鮮樣品采自當歸主產區甘肅岷縣，經甘肅中醫藥大學藥學院李成義教授鑒定為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的根。將采集的新鮮當歸根做不同的干燥處理，樣品信息見表1。

表1 當歸樣品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件[12]

色譜柱為TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～25 min，5%～25%A；25～40 min，25%～55% A；40～60 min，55%～80% A)，流速0.6 mL·min-1，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取阿魏酸、綠原酸、洋川芎內酯A、正丁基苯酞對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解于10 mL容量瓶中，配制成質量濃度為0.21、0.25、0.14、0.06 mg·mL-1的阿魏酸、綠原酸、洋川芎內酯A、正丁基苯酞混合對照品溶液；精密稱定Z-藁本內酯對照品15.23 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至5 mL，即為Z-藁本內酯對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取當歸藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 50%甲醇水，密塞，稱定重量。超聲提取40 min后冷卻，再以50%甲醇水補足減失的重量，搖勻，靜置。取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取S11號樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，連續進樣6次，檢測指紋圖譜。各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.56%，相對保留時間RSD均小于0.3%。將連續進樣6次得到的色譜圖導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.1版)進行相似度分析，結果顯示相似度均大于0.990，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取S11號樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備1份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進樣檢測，測得各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.93%，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.25%。將樣品圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.1版)進行相似度分析，結果顯示相似度均大于0.990，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 分別取S11號樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，分別進樣檢測。測得各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.67%，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.2%。將得到的圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.1版)進行相似度分析，結果顯示相似度均大于0.990，表明方法重復性良好。

2.5 當歸藥材指紋圖譜研究

2.5.1 指紋圖譜的建立 取42批當歸藥材按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，得到當歸不同干燥品的液相色譜圖。取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內酯對照品按“2.2”項下制備對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，得到綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯A、正丁基苯酞的混合對照品的液相色譜圖和Z-藁本內酯對照品的液相色譜圖，見圖1。將42批當歸藥材的液相色譜圖導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.1版)，設S41為參照圖譜，采用中位數、時間窗為0.1的方法，經多點校正后對色譜峰進行全譜圖匹配，見圖2，并生成共有模式的對照指紋圖譜，見圖3。

2.5.2 共有峰的標定 根據所建立的當歸指紋圖譜，在對照指紋圖譜上共標定出24個共有峰，見圖3。通過與對照品溶液色譜圖的比對，指認了其中的4個共有峰，分別為7號峰綠原酸、11號峰阿魏酸、22號峰洋川芎內酯A、24號峰Z-藁本內酯。經比對，22號峰后緊接著出的峰(52.4 min)為正丁基苯酞，在某些樣品中未檢測到該峰。其中11號峰阿魏酸分離度高，是2015年版《中華人民共和國藥典》規定的當歸指標性成分且峰面積較大，故以其作為參照峰計算其余各峰的相對保留時間和相對峰面積。結果發現不同干燥處理的樣品相對保留時間RSD均<3%，而相對峰面積的RSD偏大，說明當歸不同干燥品的共有成分相對含量差異較明顯。

2.5.3 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012.1版)對 42 批樣品的指紋圖譜數據進行分析，計算 42批當歸和對照指紋圖譜之間的相似度，結果見表2，相似度均大于0.920，表明當歸不同干燥品間相似度較好。

2.5.4 當歸不同干燥品HPLC指紋圖譜比較 根據計算得到的共有峰相對保留時間和相對峰面積分析，當歸不同干燥品差異主要集中在峰面積上，即化學成分的種類差別不大，但各共有峰對應化學成分的含量均有明顯差異。值得注意的是，S40～S42(陰干樣品)中正丁基苯酞峰(出峰時間52.4 min)未檢測到，可能是因為陰干過程耗時長，該成分損耗較大；S37～S39(熏干樣品)在13.2 min處比其他樣品多出了1個峰，且峰面積較大，可能為傳統熏干當歸的特征峰。

注：1.綠原酸；2.阿魏酸；3.洋川芎內酯A；4.正丁基苯酞；5.Z-藁本內酯。圖1 混合對照品HPLC圖(A)和Z-藁本內酯對照品HPLC圖

圖2 42批當歸藥材疊加指紋圖譜

圖3 對照指紋圖譜

表2 不同干燥品指紋圖譜相似度評價

2.6 主成分分析

將共有峰峰面積導入SPSS 21.0軟件，對24個共有峰進行主成分分析，得到24個共有峰的初始特征值和方差貢獻率(表3)。前5個成分的方差累積貢獻率達86.093%，特征根大于1，可以代表當歸指紋圖譜中24個共有峰的大部分信息。由因子載荷矩陣得到主成分載荷矩陣U，以特征向量U值作為系數，得到5個主成分的表達式，將原始變量標準化處理后計算得到Y1、Y2、Y3、Y4、Y5的值。以各公因子的旋轉之前的方差貢獻率為權重系數，計算當歸不同干燥品的綜合得分，Y=0.418Y1+0.186Y2+0.128Y3+0.077Y4+0.052Y5。由表4可知，排名靠前的樣品有60 ℃微波干燥、減壓干燥、60 ℃熱泵干燥品。

表3 主成分特征值及方差貢獻率

表4 當歸不同干燥品綜合得分及排名

2.7 聚類分析

以主成分得分作為變量，運用組間聯接法進行系統聚類分析，結果見圖4。當歐氏距離為25時，14批樣品可分為兩大類，S37、S38、S39聚為一類，其余樣品聚為另一類，即熏干樣品單獨聚為一類，其余干燥方法得到的樣品聚為一類。歐氏距離為18時，剩余干燥品聚為兩類，陰干和曬干品聚為一類，其余聚為另一類。

圖4 當歸指紋圖譜聚類分析

3 討論

為保證建立的當歸不同干燥品HPLC指紋圖譜出峰數目多、分離度好，本實驗前期對色譜條件進行了考察。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1%乙酸水三種流動相，發現以乙腈-1%乙酸水溶液為流動相分離效果最佳，出峰數目多，故選擇乙腈-1%乙酸水溶液為流動相；考察了235、254、275、280、320 nm五個檢測波長，發現在280 nm下，圖譜基線平穩，色譜信息較為全面，故選擇280 nm作為檢測波長；考察了1.0 mL·min-1和0.6 mL·min-1兩個流速對色譜圖的影響，發現0.6 mL·min-1流速下分離效果更佳，故選擇0.6 mL·min-1作為最佳流速。

本實驗運用相似度評價、主成分分析和聚類分析方法對當歸不同干燥品HPLC指紋圖譜進行分析。相似度分析結果顯示，各樣品間相似度均大于0.920，表明當歸不同干燥品間相似度良好。主成分分析結果顯示60 ℃微波干燥、減壓干燥、60 ℃熱泵干燥樣品排名靠前，而評分較低的的幾批當歸為曬干、陰干、熏干品。當歸為油質類藥材，減壓干燥能最大程度的減少干燥過程中化學成分的損失，傳統陰干、曬干、熏干品干燥時間長，干燥效率低，在長期干燥的過程中，伴隨失水其化學成分的含量明顯降低。本實驗結果排名靠前的樣品有60 ℃干燥品，跟相關文獻報道[13-14]有出入，基于此研究結果，可能的原因是高溫干燥下鮮藥材快速失水，致使藥材表面形成“硬皮”，藥材內部失水變緩，化學成分損失亦減緩。

2015年版《中華人民共和國藥典》描述的當歸干燥方法為熏干，歷史上鮮有本草記載以熏干為當歸干燥方式。聚類分析發現，熏干樣品單獨聚為一類，其余干燥品聚為一類，說明傳統陰干、曬干和現代干燥方法得到的當歸藥材質量較為一致，可為現代干燥技術在當歸藥材初加工的應用提供一定科學依據。