EMS誘變三七種子獲得抗衰老植株

周 璇, 韓 麗,戴 蕾,平翔蕊,蔣 麗,何霞紅,杜云龍

(1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201； 2.云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南農業大學，云南 昆明 650201；3 云南農業大學 農業生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室， 云南 昆明 650201)

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen是五加科人參屬植物，在我國屬于傳統名貴中藥材。三七含有的三七皂苷等有效成分具有散瘀止血、消腫定痛的功效。據記載，三七在我國已有600 a以上的藥用歷史，馴化栽培歷史已逾400 a[1～2]。但是，三七的人工種植受到環境條件、病害(立枯病、根腐病、圓斑病和疫病)、蟲害(蚜蟲、紅蜘蛛和介殼蟲)[3]和連作障礙的嚴重影響[4]。因此，上述因素造成了三七的種植條件要求較高、生產難度大、產量低。我們將通過化學誘變的方法篩選具有適應不同環境條件如低溫的三七植株,為三七育種提供種質資源。化學誘變是篩選植物突變體的常用方法。化學誘變劑可分為烷化劑、堿基類似物和嵌入染料三大類[5]，常見的化學誘變劑有甲基磺酸乙酯(EMS)、疊氮化鈉(NaN3)和平陽霉素(PYM)。EMS因其低成本，易操作，專一性高而成為應用普遍的誘變方法，無論是種子、愈傷組織、花粉及小孢子等均可作為誘變對象[6]。目前EMS作為常用和有效的化學誘變劑，已經被廣泛應用于水稻、小麥、玉米、大豆[6]、油菜[7]、甜橙[8]及草莓[9]的育種。EMS烷化作用誘發的點突變或染色體缺失均能穩定地遺傳給子代[10]，并且產生的突變體大多為顯性突變體，方便田間觀察[11]。EMS誘變突變植株的染色體畸變情況少，突變率高，在小麥中的突變概率為1/41.55 kb[12]，擬南芥為1/170 kb[13]。因此，利用EMS誘變方法，經過選育可以獲得所需的植株表型。三七目前沒有人工選育的品種，并且暫無研究者利用EMS等化學誘變的方法選育三七品種。在該項研究中，我們將選用不同濃度的EMS誘變三七種子，從而篩選一批表型發生明顯變化以及具有抗衰老特征的三七突變體植株，為三七產業的發展提供種質資源；同時，也為使用EMS誘變技術開展中藥材育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

三七種子來源于云南文山三七市場。所用到的主要試劑有0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)，0.06 mol·L-1PBS，0.3%、0.4%、0.5% 的EMS溶液。EMS溶液用1.2 mg·mL-1的EMS母液配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 EMS 誘變三七實驗方法 將成熟的三七種子清洗干凈，分別用0.06 mol·L-1PBS，0.3%、0.4%、0.5%的EMS誘變劑浸泡15 h。用5%硫代硫酸鈉溶液對誘變三七種子的EMS溶液進行中和反應10 min 后，三七種子在流水下沖洗2 h，對種子進行子沙埋培養，待三七種子發芽后，將其種植在云南農業大學在 “三七現代農業研究和中試基地”。

1.2.2 抗衰老植株篩選 將EMS誘變處理后的三七種子種植三七大棚中，并同時種植經0.06 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)處理的種子作為對照。經過4 a種植后，根據植株地上部分的枯萎狀態篩選具有抗衰老特征的三七。

1.2.3 測定植物內源激素 對四年生的具有抗衰老特征的誘變三七的葉片進行取材，對照為同一時期種下的未經EMS誘變的野生型三七植株葉片。三七葉片稱取量不低于200 mg，使用液相色譜-質譜聯用儀(HPLC-MS/MS)測定內源激素的種類及含量。

2 結果與分析

2.1 EMS誘變三七種子的萌發率

采用0.3%、0.4%、0.5%三個濃度的EMS溶液處理三七種子，與PBS處理的對照組同時種在大棚內。0.3%EMS誘變的三七播種1 186顆，出苗449顆,出苗率37.9%；0.4%EMS誘變的三七播種1 180顆，出苗470顆，出苗率39.8%；0.5%EMS誘變的三七播種1 182顆，出苗438顆，出苗率37.1%，而對照組的出苗率為43%(圖1)。因此，EMS溶液對三七種子的發育具有一定的抑制作用。

圖1 EMS處理降低三七種子出苗率

2.2 EMS處理可影響三七植株表型

經EMS誘變處理后三七小苗種植于三七大棚內，生長2 a后，有些植株的表型發生變異，主要表現為：葉片明顯變小變窄(圖2B)、花型變小(圖2C)、植株葉片發育不完全(圖2D)。但是，發生上述表型變化的三七植株數量少，在生長過程中的存活率相比野生型低，這暗示上述突變對三七的生長是有害突變。

注：A：野生型植株， B：葉片變小變窄植株， C：花型變小植株， D：葉片發育不完全植株

2.3 EMS處理可獲得抗衰老三七植株

EMS誘變后的三七植株種植4 a后，發現在冬季到來前，部分誘變三七與對照三七生長狀態出現明顯不同。在2017年11月3日觀察時發現有3株EMS誘變三七的地上部分生長狀態良好，種皮綠色或微紅，未出現衰老現象(圖3B)，而同期對照三七的葉片已經枯萎(圖3A)。1個月后的跟蹤觀察發現對照三七地上部分幾乎全部枯萎，莖桿倒伏(圖3C)，但3株EMS誘變三七中的1株(EMS1)的葉片仍為綠色，種皮微紅，另2株(EMS2,EMS3)的種皮紅色，葉片開始變黃(圖3D)。對照三七與EMS誘變三七生長于同一塊大田中，其光照、溫度、水分等環境條件均相同，但其抗衰老能力明顯不同。因此，EMS誘變可以篩選到具有抗衰老能力的三七植株，從而增加三七對非生物脅迫的抗性。

注：A, B：植株觀察于2017年11月3日；C, D：植株觀察于2017年12月3日; CK是未經誘變的對照植株

圖4 三七突變體內源激素含量

為了進一步分析EMS誘變三七的抗衰老機制，2017年11月3日我們對3株抗衰老三七(即EMS1/EMS2/EMS3)和同一塊大田的對照三七進行葉片采樣，檢測葉片中植物激素水楊酸(SA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸-異亮氨酸(JA-Ile)的含量。在3株EMS誘變三七中，IAA的含量均明顯升高(圖4B)，但ABA的含量在EMS2株系中顯著增加，而在EMS1株系中降低，在EMS3株系中與對照植株相比沒明顯變化(圖4A)。對JA的含量測量后，發現EMS1和EMS2株系的茉莉酸含量明顯升高，EMS3的含量沒有發生明顯變化(圖4C)。而在JA-Ile的測量中，發現EMS1和EMS2株系的JA-Ile含量明顯升高，EMS3株系的含量明顯降低(圖4D)。對SA含量進行測量后，發現EMS1株系中的水楊酸含量明顯升高，而EMS2和EMS3株系中的水楊酸含量與對照植株相比沒有明顯的差別(圖4E)。

3 討論

三七是我國傳統名貴中藥，但長期以來，三七由于沒有人工選育品種，導致三七在生產中面臨許多問題[14]。在該項研究中，我們發現部分經EMS誘變的三七的花及葉的表型發生了明顯的變異，部分EMS誘變的三七植株表現出抗衰老的能力。這顯示利用EMS誘變技術，可以使三七產生豐富的遺傳多樣性，有利于選育性狀優良的三七品種。利用EMS誘變的方法，在選育具有目標性狀的植株上有著明顯的作用。目前，在包括馬鈴薯、豇豆、金葵花等食用作物上都獲得了性狀優異的植株[15]。例如，甘藍型油菜經EMS誘變的后代在子葉、葉片、花器、株型、角果和種皮這6個器官均發生了不同頻率的突變[6]。在該項研究中，我們發現三七對EMS濃度具有依賴性(圖1)。在獲得的EMS突變體中，發現少量突變體的花及葉表型發生了有害突變(圖2)，并且EMS誘變后三七出苗率降低，我們猜測EMS誘變對三七具有一定的致死效應。

植物激素對植物的生長發育起到非常重要的作用。在植物激素中，IAA可調控植物的生長發育[16]，脫落酸[17]、水楊酸與茉莉酸同植物的衰老密切相關[18～21]。當植物處于不良環境脅迫時，水楊酸會迅速在植物體內積累，減少不良環境對植物的影響[18]。在植物衰老過程中，水楊酸可以延緩蛋白質降解，達到減緩植物衰老的作用[19]。當植物受到水分、干旱、病原菌和昆蟲脅迫時，體內的茉莉酸含量顯著增加，以維持生長[20]。此外，茉莉酸和ERF轉錄因子也參與調控植物葉片衰老[21]。在我們所篩選的抗衰老三七突變體中，發現三七突變體EMS1, EMS2及EMS3植株的生長素含量都明顯高于野生型(圖4B)，這與植株的地上部分的生長狀態相符合。但我們同時發現具有抗衰老能力的EMS1植株的ABA含量明顯降低 (圖4A)，同時伴隨有水楊酸(圖4E)、茉莉酸(圖4C)和茉莉酸-異亮氨酸(圖4D)含量的明顯增加。這暗示在三七生長中，增加脫落酸的含量會促進三七的衰老。水楊酸在植物遭受干旱、寒冷、病原物入侵時會大量產生[22]，以保證植株健康生長[23]。EMS1株系中水楊酸含量最高，并且在三個抗衰老突變體EMS1， EMS2及EMS3植株中，地面部分最晚衰老(圖3D)，水楊酸含量的升高可能有助于三七延緩衰老，這可能與水楊酸提高三七對低溫的抵抗能力有關。有研究發現茉莉酸會通過抑制光合作用等機制促進植物衰老[24～25]。在EMS1突變體三七中，我們發現JA及JA-Ile的含量升高(圖4C，D)，這暗示了水楊酸與ABA，JA及JA-Ile的相互作用對調控三七衰老過程起到重要作用，但是相關的機制還有待進一步深入研究。對抗衰老三七植株中的內源激素含量分析，有助于揭示三七在非生物脅迫條件如低溫、干旱下生長的機制，從而有利于合理使用植物激素，促進三七產業的健康生長。

4 結論

通過EMS誘變的方法，我們獲得一些表型發生變化的三七植株,包括葉片畸形，葉片發育不完全、花型小等。同時，初步篩選到具有抗衰老能力的三七突變體植株，其中水楊酸、生長素、脫落酸、茉莉酸和茉莉酸-異亮氨酸的相互作用對三七的正常生長起到非常重要的作用。