枸骨基因組DNA提取方法比較研究

曾慧，榮華，羅彩霞，胡回 趙煒煒，王安明，張威威

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

枸骨(Ilexcornuta)為冬青科冬青屬常綠灌木或小喬木，是常用園林綠化樹種之一。枸骨還是一味傳統(tǒng)中藥，其根、枝、葉、果實和樹皮均可入藥，具有多種藥用功效，可以醫(yī)治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)酸痛、頭痛、牙痛、頭暈、目眩、耳鳴和高血壓等多種常見病[1]。枸骨葉中主要含有三萜及其皂苷、黃酮及多酚類化合物，以及多種微量元素等，其中三萜皂苷具有抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇、提高機體免疫功能等作用[2]。因此，枸骨有重要的商業(yè)和藥用價值，而從枸骨葉片中提取高質(zhì)量的DNA是進行枸骨分子生物學(xué)與遺傳學(xué)研究的前提。

植物DNA提取的方法有很多，如CTAB法、SDS法、高鹽低pH法等[3]。但因不同植物的內(nèi)含物和組分有所差異，最適DNA提取方法也不盡相同。枸骨作為冬青科植物，葉片含有較厚的角質(zhì)層，細(xì)胞內(nèi)含有多糖、酚類等次生代謝物[4]，影響DNA提取產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，關(guān)于枸骨葉DNA提取方法研究并不多，本研究以枸骨葉為材料，比較改良CTAB法、改良SDS法、高鹽低pH法、PVP法4種方法提取枸骨葉基因組DNA的效果，選出最適提取方法，為枸骨生物學(xué)研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枸骨嫩葉片采摘于長江大學(xué)西校區(qū)校園內(nèi)，采摘的枸骨葉片經(jīng)過液氮速凍后儲存在-80°C的超低溫冰箱備用。主要試劑有CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、EDTA、NaAc、NaCl、無水乙醇、三氯甲烷、異戊醇等，所有試劑均為分析純。

1.2 DNA提取方法

參照文獻[5]采用改良的CTAB法。稱取0.5g研磨粉末于10mL離心管中，加入4mL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液(2%的CTAB，100mmol/L的Tris-HCl pH8.0，150mmol/L的EDTA，2100mmol/L的NaCl，2%的PVP，2%的β-巰基乙醇)，充分混勻后于65℃中保溫30min，不時輕輕顛倒混勻，取出稍冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩混勻，4℃，轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min。靜置分層后，取上清重復(fù)加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，重復(fù)離心步驟；再取上清液加入1.5倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇輕微混勻，-20℃靜置30min沉淀DNA，4℃、12000r/min離心10min；用70%的乙醇洗滌沉淀2次，倒掉洗滌液，自然干燥后，加1mL的無菌水溶解。

改良SDS法參照文獻[6]，高鹽低pH法參照文獻[7]，PVP法參照文獻[8]。

用以上4種不同方法提取枸骨葉DNA時，每個離心管中加樣品量為0.5g，加入提取液均為4mL，每種方法進行3管重復(fù)。對提取的DNA，每毫升加入RNA酶(10μg/mL)量10μL，37℃水浴鍋內(nèi)水浴3h并純化。

1.3 DNA的檢測

將提取的DNA溶液全部稀釋100倍，每管取100μL在核酸測定儀上測定各樣品DNA質(zhì)量濃度以及260nm和280nm波長下的光密度值，通過D260nm/D280nm比值來檢測提取的DNA純度。

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的枸骨葉DNA，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠電泳檢測結(jié)果

圖1 利用4種方法提取的枸骨葉DNA電泳圖

用4種方法分別提取枸骨葉DNA，凝膠電泳檢測提取的DNA，電泳結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，利用4種方法均提取到枸骨葉DNA中，改良CTAB法提取的DNA效果最好，有清晰的電泳條帶，無拖尾，說明DNA保持較好的完整性。改良SDS法提取的枸骨葉DNA電泳有拖尾，點樣空有雜質(zhì)殘留，說明多酚類等物質(zhì)去除不完全，而PVP法和高鹽低pH法提取的DNA電泳條帶較暗。

2.2 核酸測定儀檢測結(jié)果

表1 利用4種方法提取的枸骨葉DNA質(zhì)量濃度和D260nm/D280nm值

提取的DNA用核酸測定儀進行檢測。由表1可知，改良CTAB法提取的DNA質(zhì)量濃度平均值為0.77μg/mL，高于改良SDS法提取的DNA質(zhì)量濃度(0.37μg/mL)，遠(yuǎn)高于PVP法和PVP法提取的DNA質(zhì)量濃度，這表明改良CTAB法提取枸骨葉DNA效果更優(yōu)，與電泳結(jié)果保持一致。

通常情況下，質(zhì)量較好的DNA的D260nm/D280nm值在1.6～1.8之間。從表1可以看出，改良CTAB法提取的DNA質(zhì)量較好，D260nm/D280nm值在1.6～1.8之間。而PVP法、改良SDS法和PVP法提取的枸骨葉DNA的260nm/D280nm均低于1.6，表明提取的DNA質(zhì)量較差。該檢測結(jié)果進一步證實改良CTAB法更適合提取枸骨葉DNA。

3 討論

目前，植物DNA提取的研究已有大量報道。植物的材料狀況、提取液的差異、氯仿/異戊醇的比例等都可以影響基因組DNA的提取[9]。不同類別的植物，DNA提取的方法會有一定差異。宣樸等[10]研究認(rèn)為通過CTAB法提取小麥、黑麥、水稻、玉米等植物的DNA，效果較好。郝會海等[11]利用簡化的SDS法提取楊樹的DNA，電泳檢測發(fā)現(xiàn)DNA條帶整齊、清晰。利用改良的SDS法適合提取石韋基因組DNA[12]，而改進的高鹽低pH法適合分離和純化棉花葉綠體及葉綠體DNA[13]。

本試驗采用相同生長狀況的枸骨葉片材料，比較了改良CTAB法、改良SDS法、高鹽低pH法、PVP法提取DNA的效果。從4種方法對枸骨葉DNA的提取效果看，雖然均可成功提取枸骨葉DNA，但改良SDS法提取DNA雜質(zhì)殘留較多，高鹽低pH法、PVP法提取的DNA得率較低。改良CTAB法提取DNA的260nm/D280nm在1.61～1.68之間，得率較高，凝膠電泳結(jié)果顯示無拖尾現(xiàn)象，表明改良的CTAB法提取的枸骨葉DNA較純，完整度好。所以，改良的CTAB法更適合枸骨葉DNA提取。張春曉等[4]在冬青衛(wèi)矛DNA提取研究時發(fā)現(xiàn)，改良的CTAB法能分離出高純度、高產(chǎn)量的DNA，這與本試驗結(jié)果相似。因此，改良的CTAB法最適合枸骨葉DNA的提取，該結(jié)論可為冬青科冬青屬植物葉片中DNA的提取提供參考依據(jù)。