羊肚菌蛋白抗壞血酸化修飾工藝優化

潘威威,王照莉,王苗苗,童妃妃,張強

(安徽科技學院生命科學學院，安徽 鳳陽 233100)

羊肚菌(Morchellaesculenta)是一種原產于中國的食、藥用真菌，也是公認的健康食品和藥物開發無可比擬的資源[1]。羊肚菌中含有蛋白質、脂肪、礦物質、膳食纖維和碳水化合物等多種營養成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌和增強人體免疫力等多種藥用特性[2，3]。羊肚菌中的蛋白質含量高達32.7%，富含8種人體所必需的氨基酸，是營養食品和功能性食品開發的極好材料，但尚未廣泛被人類利用[4，5]。

近年來，蛋白質的共價修飾已成為保健品和功能性食品領域研究的熱點之一。借助共價修飾，在蛋白質分子表面結合一些化合物可以使蛋白質的結構、理化性質和生物學功能發生顯著的變化[6]。已有研究表明，利用糖類或酚類對蛋白質進行共價修飾，可顯著提高原蛋白的抗氧化活性[7，8]?？箟难嵊置S生素C(VC)，是一種以抗氧化功能為特色的人體必需的水溶性維生素。VC具有抗腫瘤活性，能夠增強人體免疫力，預防心腦血管疾病，還能夠通過清除自由基而起到延遲人體衰老的作用[9，10]。而且，VC分子中含有羰基，能夠借助美拉德反應與蛋白質分子表面的氨基發生共價結合。用VC對羊肚菌蛋白(MPI)進行抗壞血酸化修飾有望賦予產物VC和原羊肚菌蛋白的雙重營養和功能特性，但是，至今以VC修飾MPI的研究尚未見報道。因此，本研究以總抗氧化活性為考察指標，探討不同因素對MPI抗壞血酸化修飾的影響，并用響應面法優化MPI抗壞血酸化修飾的最佳工藝條件，以為將其作為保健品和功能性食品的開發和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

羊肚菌菌種(ACCC 50537 )購自中國農業微生物菌種保藏管理中心；L-抗壞血酸、鉬酸銨、磷酸鈉和硫酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑總公司。

主要儀器中756MC型紫外可見分光光度計和PHSJ-4A型精密pH計均購自上海精密科學儀器有限公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機購自北京博醫康實驗儀器有限公司；H-18R型臺式高速冷凍離心機購自北京安必升科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1MPI的提取

參照文獻[11]采用液態發酵的方法獲得羊肚菌菌絲體。然后，將菌絲體凍干，粉碎，按文獻[12]的方法提取羊肚菌蛋白(MPI)。

1.2.2MPI的抗壞血酸化修飾

將0. 10g MPI溶于10mL 蒸餾水，按設定的比例加入VC，調整pH為所需，密封，沸水浴加熱一定時間，冰浴冷卻，用3500Da (3500u)的透析袋透析48h，凍干，得到抗壞血酸化修飾的羊肚菌蛋白(VC-MPI)。

1)單因素試驗 選取pH(9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)、抗壞血酸與MPI的質量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)及反應時間(30、60、90、120、150min)3 個因素，分別設置不同的水平，進行單因素試驗，確定各因素對羊肚菌蛋白抗壞血酸化修飾的影響。

2)響應面優化試驗 根據單因素試驗結果，以pH、抗壞血酸與羊肚菌蛋白的質量比及反應時間為考察因素，以總抗氧化活性為響應值，使用軟件Design Expert 8.06的 Box-Behnken 設計模式進行3因素3水平的響應面試驗，優化MPI的抗壞血酸化化修飾工藝。

1.2.3總抗氧化活性的測定

參照文獻[13]的方法配制鉬酸銨反應體系。每3mL的鉬酸銨反應體系中加入0.3mL樣品，混合均勻，于95℃恒溫水浴鍋中孵育90min，室溫冷卻后，在695nm處測定光密度D695nm值，樣品液的光密度值越大，其總抗氧化能力越強。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1pH對抗壞血酸化修飾的影響

pH對VC-MPI總抗氧化活性的影響結果如圖1所示。由圖1可知，隨pH的升高，VC-MPI的總抗氧化活性呈現先升后降的趨勢，pH為12.0時，VC-MPI的總抗氧化活性最強。

2.1.2VC與MPI質量比對抗壞血酸化修飾的影響

VC與MPI質量比對VC-MPI總抗氧化活性影響的結果見圖2。圖2結果表明：隨著反應中VC加入量的增加，總抗氧化活性逐漸升高，當VC與MPI質量比為4∶1時達到最大值，之后再提高VC的用量，總抗氧化活性略有下降。這是由于在一定范圍內增加反應體系中VC的用量，可推動反應向正方向進行，因而產物的總抗氧化活性提高。但當所有的MPI為VC所飽和時，再提高VC的用量，產物的總抗氧化能力不會再提高。

圖1 不同pH下的總抗氧化活性 圖2 不同VC與MPI質量比下的總抗氧化活性

圖3 不同反應時間下的總抗氧化活性

2.1.3反應時間對抗壞血酸化修飾的影響

反應時間對VC-MPI的總抗氧化活性影響的結果見圖3。圖3結果表明：隨著反應時間的延長，總抗氧化活性逐漸升高，120min時達到最大值，之后開始下降，這可能是過長的反應時間導致了產物的降解。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1模型預測與統計分析

表1 響應面設計及試驗結果

注: 括號中數據為真實值。

響應面試驗的因素和水平設計及對應試驗結果如表1所示。借助 Design Expert 8.06軟件對表1 中試驗數據進行多元回歸擬合，獲得總抗氧化活性對自變量pH(X1)、VC與MPI質量比(X2)及反應時間(X3)的二次多項回歸方程:

由表2方差分析的結果可知，模型的F值為 324.62，P<0.0001，表示模型極顯著，失擬項F值是1.03，P= 0.4680 > 0.05，表示失擬不顯著。模型總決定系數為0.998，校正決定系數為0.995，說明該實驗實際值與預測值具有很高的相關性，信噪比(49.12)遠遠大于4，變異系數(1.14%)較小，表明模型方程對實驗擬合良好，可信度較高，能夠準確地反映響應值(總抗氧化能力)隨各因素的變化規律。由表2中的F值可知，3個試驗因素對響應值的影響程度大小依次為pH(X1)>反應時間(X3)>VC與MPI的質量比(X2)。模型二次項(X12、X22、X32)、一次項中的X1、X3及交互相X1X2、X1X3和X2X3均達到顯著水平(P<0.01)，該結果說明總抗氧化能力受各個因素的影響并不是簡單的線性關系。

表2 響應面模型的方差分析

注: **表示極顯著水平(P<0.01)?？倹Q定系數R2=0.998，校正決定系數R2=0.995，信噪比49.12，變異系數1.14%。

2.2.2響應曲面圖分析與優化

根據回歸模型繪出了3 個因素交互作用的響應曲面圖和等值線圖(圖4)。從圖4可知：各曲面圖上均存在最高點，說明響應面的設計較為合理。

圖4 響應面分析圖

由圖4中各曲面的斜度及等值線的形狀可以看出，pH和VC與MPI質量比的交互作用最大，對抗壞血酸化反應的影響最大，表現為曲線較陡，等值線呈明顯的橢圓狀；反應時間與pH的交互作用次之，對抗壞血酸化反應有一定程度的影響；而VC與MPI質量比與反應時間的交互作用最小，對抗壞血酸化反應的影響也較小，這與表2中的顯著性檢驗結果相一致。在模型范圍內，令響應值最大化，通過Design-Expert軟件得到MPI壞血酸化修飾的的最佳條件如下：pH 12.22，VC與MPI質量比4.01∶1，反應時間127.26min，總抗氧化活性可達0.891。考慮到實際操作的方便性，修正上述工藝條件為：pH 12.20，抗壞血酸與羊肚菌蛋白質量比4.0∶1，反應時間130min，在該條件下進行了3次平行驗證實驗，產物的總抗氧化活性為0.876，與理論值基本吻合，表明該模型可以較好地預測MPI的抗壞血酸化修飾情況。

3 結論

MPI抗壞血酸化修飾的最佳工藝條件為：pH 12.20，VC與MPI質量比4 ∶1，反應時間130min。本研究獲得了一種行之有效的MPI的抗壞血酸化修飾方法，為MPI在功能性食品和營養保健品方面的開發應用奠定了基礎。