hTWEAK基因重組慢病毒載體構(gòu)建、病毒包裝及蛋白表達(dá)分析

許媛，趙明才

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系；3.川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充 637000；4.遂寧市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 遂寧 629000)

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，每年全球約有100萬人患HCC[1-2]，其中約50%發(fā)生在中國[3-4]。腫瘤壞死因子樣微弱凋亡誘導(dǎo)劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是腫瘤壞死因子配體超家族的成員之一。TWEAK由249個氨基酸組成，經(jīng)蛋白酶處理后成為含156個氨基酸的可溶性細(xì)胞因子，與細(xì)胞腫瘤壞死因子受體超家族成員Fn14結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TWEAK/Fn14信號通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞增殖、存活、侵襲及血管生成等生物學(xué)過程中具有重要的作用[5-6]。因此，調(diào)節(jié)TWEAK表達(dá)可能成為腫瘤治療的新策略。本研究通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶TWEAK基因的慢病毒載體，并通過PCR、間接免疫熒光和Western Blot技術(shù)對TWEAK進(jìn)行表達(dá)分析，為探討TWEAK在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人胚腎細(xì)胞293T(購自美國ATCC)，人肝癌細(xì)胞系HepG2(川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心保存)。

1.2 載體及主要試劑

慢病毒包裝質(zhì)粒(pMD2.G、pCMV-VSV-G、pRSV-Rev)及慢病毒載體質(zhì)粒(Plentilox3.7)均由川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心郭曉蘭教授惠贈；大腸桿菌DH5α由川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM購自Hyclone公司、胎牛血清FBS和胰酶(0.25%，含EDTA)購自Gibco公司、青霉素(10 000 U/mL)和鏈霉素(10 000 μg/mL)購自華北制藥公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Gibco公司；qRT-PCR mix 購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶(NheⅠ和BsrGⅠ)、T4 DNA連接酶、DNA maker購自Fermentas公司； Lipofectamine TM 2000、Trizol 購自美國Invitrogen公司；酵母提取物及胰蛋白胨購自O(shè)xioid公司。

1.3 TWEAK基因擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增人TWEAK基因序列：根據(jù)TWEAK基因CDS區(qū)(GenBank:AF030099.1，GI:2707219，1 306 bp)及酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(表1)，以質(zhì)粒pORF5-hTWEAK為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，62 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35 cycles；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增完成后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

表1 人TWEAK基因擴(kuò)增引物序列

1.4 Plentilox3.7-TWEAK重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

將擴(kuò)增的hTWEAK基因片段及載體質(zhì)粒Plentilox3.7在37 ℃條件下用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和BsrGⅠ進(jìn)行雙酶切，2 h后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳。切下含目的片段的凝膠，按照膠回收試劑盒提供的方法回收目的片段。在T4 DNA連接酶作用下將目的基因連接至Plentilox3.7載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α并進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，挑取單個菌落、增菌、提取質(zhì)粒，將提好的質(zhì)粒用NheⅠ和BsrGⅠ酶進(jìn)行雙酶切并通過PCR進(jìn)行鑒定。取測序正確的克隆進(jìn)行增菌，用除內(nèi)毒素大提試劑盒大量提取陽性重組質(zhì)粒。

1.5 慢病毒包裝

復(fù)蘇293T細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按5×106/盤的量接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞至70%～80%融合度時更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。利用脂質(zhì)體Lipofectamin2000TM將含hTWEAK的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pMD2.G、pCMV-VSV-G、pRSV-Rev)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(包裝含hTWEAK基因的病毒，實(shí)驗(yàn)組)，同時將不含hTWEAK的質(zhì)粒和上述三種包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(包裝不含hTWEAK基因的病毒，對照組)。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，72 h后收集培養(yǎng)上清液即為過表達(dá)hTWEAK的病毒液以及無hTWEAK的陰性對照病毒液。將收集的上清液在4 ℃、3 000 g離心力條件下離心10 min后收集上清液。用0.45 μm濾器過濾離心后的上清，無菌分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 重組病毒感染目的細(xì)胞

將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞鋪入24孔板中，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右。從-80 ℃冰箱取出病毒液冰上融化，分別按照1∶10和1∶100的比例配制病毒懸液和完全培養(yǎng)基的混合液，加入10 μg/mL的Polybrene以提高感染率，同時設(shè)置陰性對照組。在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。

1.7 qRT-PCR檢測HepG2細(xì)胞中TWEAK基因相對表達(dá)量

從培養(yǎng)箱取出24孔板，收集上清后采用0.25%胰酶消化細(xì)胞，3 500 rpm/min離心5 min收集細(xì)胞，加入1 mLTrizol試劑混勻，按照說明書提取細(xì)胞總RNA，采用NanoDrop 2 000 c微量分光光度計(jì)測量RNA濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用SYBR Green染料法檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組中TWEAK mRNA相對表達(dá)量。

1.8 免疫熒光法檢測HepG2細(xì)胞中TWEAK表達(dá)

取出24孔板，去上清后用PBS洗滌2次。采用多聚甲醛(4%)固定細(xì)胞15 min后，用TBST洗滌3次，再將含0.1% Triton X-100和5% BSA的封閉液加入培養(yǎng)皿中封閉，1 h后棄去封閉液，滴加1∶100稀釋的兔抗人TWEAK工作液，4 ℃ 孵育過夜。棄去工作液后再用PBS洗滌3次，滴加1∶64稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔工作液，37 ℃孵育30 min。孵育結(jié)束后用PBS洗滌3次，滴加DAPI工作液(1∶1 000稀釋)室溫孵育5 min，PBS洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察。

1.9 Western Blot檢測HepG2細(xì)胞中TWEAK表達(dá)

從培養(yǎng)箱取出24孔板，收集上清備用。收集細(xì)胞，在冰上裂解細(xì)胞30 min后 4 ℃離心收集蛋白。采用BCA法測量總蛋白濃度后，Western Blot檢測HepG2細(xì)胞中TWEAK蛋白表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hTWEAK的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

采用普通PCR技術(shù)從pORF5-TWEAK質(zhì)粒中擴(kuò)增TWEAK基因序列全長片段，其產(chǎn)物大小為750 bp。

2.2 重組質(zhì)粒Plentilxo3.7-TWEAK鑒定

2.2.1 PCR及酶切鑒定 hTWEAK基因與載體質(zhì)粒Plentilxo3.7重組，構(gòu)建Plentilxo3.7-TWEAK重組質(zhì)粒。以Plentilxo3.7-TWEAK重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增TWEAK基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后可見一條750 bp的特異性條帶；對Plentilxo3.7-TWEAK重組質(zhì)粒用NheⅠ和BsrGⅠ酶進(jìn)行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見一條750 bp條帶和7 670 bp左右的條帶(圖1)。

2.2.2 測序鑒定 挑取含Plentilxo3.7-TWEAK重組質(zhì)粒的陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后送南京金斯瑞公司基因測序(圖2)，將測序結(jié)果與NCBI-blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，重組質(zhì)粒堿基序列正確，無突變位點(diǎn)。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

2.3.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果 如圖3所示，Plentilxo3.7-TWEAK轉(zhuǎn)染組TWEAK mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3.2 免疫熒光檢測結(jié)果 免疫熒光檢測TWEAK蛋白表達(dá)及定位，其中綠色熒光信號代表TWEAK蛋白。由此可見，Plentilxo3.7-TWEAK重組質(zhì)粒能在HepG2細(xì)胞中表達(dá)，且主要分布在胞漿中(圖4)。

2.3.3 Western-blot檢測結(jié)果 如圖5所示，轉(zhuǎn)染Plentilxo3.7-TWEAK重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中，TWEAK蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組。

3 討論

TWEAK基因作為腫瘤壞死因子配體超家族中的重要成員，在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。TWEAK能通過NF-κB介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈激活和破壞緊密連接的方式促進(jìn)丙肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞[7]，也能驅(qū)動肝祖細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞之間通過細(xì)胞因子和化學(xué)因子“交叉對話”而影響慢性肝損傷病理結(jié)果[8]。TWEAK也能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，在肝癌細(xì)胞系SMMC7721中通過siRNA沉默TWEAK基因后，肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力均受到抑制[9]。TWAEK除具有促腫瘤效應(yīng)外，它同時也具有抗腫瘤效應(yīng)。TWAEK可通過JAK-STAT信號通路誘導(dǎo)大腸癌WiDr細(xì)胞產(chǎn)生β-干擾素，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，γ-干擾素可增加TWAEK誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[10]。這些研究提示，TWEAK在肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用，調(diào)節(jié)TWEAK表達(dá)可望成為疾病治療的重要途徑。

肝細(xì)胞肝癌發(fā)病隱蔽，不易早期發(fā)現(xiàn)，因此傳統(tǒng)的手術(shù)切除治療、放射治療和藥物治療是肝癌治療的主要手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤基因治療逐漸成為腫瘤最具前景的治療方式之一。腫瘤基因治療需要載體運(yùn)送基因序列或基因干擾序列。慢病毒載體是基因治療中常用的病毒載體。慢病毒載體是改造的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)載體，具有感染效率高、自身抗原性弱、表達(dá)穩(wěn)定、操控性強(qiáng)、可容納外源目的基因片段大、可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。本研究成功構(gòu)建了攜帶人TWEAK基因的慢病毒載體質(zhì)粒，并能在293T細(xì)胞中成功包裝出具有活性的慢病毒顆粒。將含有TWEAK基因的慢病毒顆粒感染HepG2細(xì)胞后，其TWEAK基因mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于不攜帶TWEAK基因的慢病毒感染的細(xì)胞。間接免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)外源性TWEAK蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，證明TWEAK基因成功轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞中并合成了目的蛋白。這些結(jié)果提示，本研究所構(gòu)建的攜帶TWEAK基因的慢病毒載體能在HepG2細(xì)胞中高效表達(dá)TWEAK，這為研究TWEAK對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。