尼莫地平激活PI3K/Akt通路對(duì)I/R老齡大鼠腦微血管生成機(jī)制研究

余翔，梁輝，曾凱敏，劉昕，彭熠，李春花，傅可

(湖南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

缺血性腦卒中為全球第二大致死因素、第一大致殘因素，多發(fā)于老年人群[1]。及時(shí)恢復(fù)缺血組織供血是治療腦缺血的關(guān)鍵，但隨之而來的缺血再灌注損傷 (ischemia reperfusion injury，I/R，是指腦部缺血區(qū)通過血管再通或側(cè)支循環(huán)建立等途徑恢復(fù)血流后而引起的腦組織損傷)會(huì)導(dǎo)致腦組織的二次損傷。研究證實(shí)微血管生成是I/R損傷后的重要保護(hù)途徑，缺血缺氧后可刺激腦組織啟動(dòng)自身血管生成機(jī)制，通過建立側(cè)支循環(huán)抵御缺血缺氧對(duì)腦組織的損害，起到腦組織保護(hù)作用[2]。研究顯示，磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphoinositide-3 kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt )信號(hào)通路在腦缺血半暗帶區(qū)微血管的生成和側(cè)支循環(huán)的建立中起重要作用[3-4]，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)老年腦缺血損傷與微血管生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究較少，本研究采用尼莫地平、PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑干預(yù)I/R損傷大鼠模型，通過檢測(cè)其腦缺血半暗帶區(qū)α-SMA 、PI3K、Akt的表達(dá)水平，探討尼莫地平對(duì)缺血再灌注老齡大鼠腦微血管生成的促進(jìn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與儀器試劑 PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002(德國(guó)，Calbiochem)；尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S1308079)；α-SMA、 PI3K及Akt試劑盒及一抗、二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；10%水合氯醛注射液(分析純，中國(guó)五聯(lián)化工廠)；多聚甲醛(分析純，北京化工廠)。OLYMPUS BX5顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD成年大鼠，20～21月齡(450～500 g)，購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2009-0002)。動(dòng)物在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度為(22±2)℃，濕度55%～70% ，每天給予清潔充足的食物和水，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注損傷模型制備 模型組、尼莫地平組及抑制劑組共144只大鼠，采用改良的大腦中動(dòng)脈線栓法[5]制備局灶性腦缺血大鼠模型：(1)腹腔注射10%水合氯醛(劑量為 3.5 mL/kg)將大鼠麻醉后，仰臥位固定，常規(guī)頸部去毛、消毒；(2)沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，并向上鈍性分離頸內(nèi)、外動(dòng)脈；游離頸外動(dòng)脈約3～4 mm，在距離頸總動(dòng)脈分叉較遠(yuǎn)處結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈拉成一直線，用微動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈;(3)在頸總動(dòng)脈上剪開一小口，在剪口處注入肝素25 U，將制備好的線栓自切口插入，并沿頸總動(dòng)脈分叉處緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇有輕微阻力即停止，此時(shí)線栓的膨大頂端恰好堵塞大腦中動(dòng)脈的開口處，固定并剪斷線栓尾部，松開頸總、頸內(nèi)動(dòng)脈的微動(dòng)脈夾，連續(xù)縫合手術(shù)切口；(4)線栓 3 h 后將插線拔出顱外(分2次進(jìn)行)，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)手術(shù)方法同上，但不用線栓堵塞中動(dòng)脈。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)表法將30只大鼠隨機(jī)分為3組：(1)假手術(shù)組和模型組：按照1 mL/100 g體重，灌胃給與生理鹽水；(2)尼莫地平組：于手術(shù)前5 d開始，按1 mL/100 g體重，每天灌胃給與1 mg/mL尼莫地平懸浮液(藥物劑量為6 mg·kg-1·d-1)；(3)于手術(shù)前5 d開始，每天灌胃給與尼莫地平，藥物劑量及灌胃量同尼莫地平組，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射LY294002(藥物劑量為0.3 mg·kg-1·d-1)。各組大鼠均于不同時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，取缺血側(cè)前額皮質(zhì)，用4%的多聚甲醛溶液固定，待做免疫組化。

1.2.3 α-SMA、PI3K及Akt的表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)：(1)將缺血側(cè)前額皮質(zhì)組織石蠟切片脫蠟至水，置于3%H2O2的PBS中，室溫孵育 10 min后，蒸餾水洗滌5 min×3 次;(2)用 5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，不洗，滴加稀釋的一抗工作液，保濕盒內(nèi)4 ℃過夜后，PBS 洗滌切片，5 min×3 次;(3)滴加稀釋的生物素化二抗，37 ℃保濕盒中孵育10～30 min，PBS沖洗切片，5 min×3 次;(4)滴加稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育 10～30 min，PBS 沖洗切片，5 min×3 次；(5)DAB顯色：使用 DAB 顯色試劑盒，取 1 mL 蒸餾水，加試劑盒中 A、B、C 試劑各1滴，混勻后滴至切片，反應(yīng) 30 min后，自來水充分沖洗，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。高倍鏡下(×400)隨機(jī)取大腦造模側(cè)皮層5個(gè)部位進(jìn)行拍攝，采用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)情況[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組和抑制劑組I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d各時(shí)間點(diǎn)的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；模型組、尼莫地平組和抑制劑組在本組內(nèi)后一時(shí)間點(diǎn)的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平前一時(shí)間點(diǎn)明顯升高(P<0.05)；與模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，尼莫地平組的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與尼莫地平組相同時(shí)間點(diǎn)比較，抑制劑組的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1-圖4。

表1 各組大鼠腦組織微血管α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平

**P<0.05，與假手術(shù)組比較；#P<0.05，與本組內(nèi)的前一時(shí)間點(diǎn)組比較；△P<0.05，與模型組相同時(shí)間點(diǎn)組比較；▲P<0.05，與尼莫地平組相同時(shí)間點(diǎn)組比較。

3 討論

血管生成作為I/R損傷后的重要保護(hù)途徑，主要包括內(nèi)源性血管生成和治療性血管生成兩方面，I/R損傷后調(diào)動(dòng)內(nèi)源性的血管生成機(jī)制促進(jìn)缺血區(qū)微血管生成及缺血性腦卒中的治療意義重大，研究顯示組織缺血缺氧后可啟動(dòng)自身血管生成機(jī)制，逐漸建立起自身側(cè)支循環(huán)，改善腦局部缺血缺氧癥狀[6]，但其改善效果往往欠佳，臨床上也可通過藥物、基因治療等方式，促使缺血組織形成新的毛細(xì)血管，此種方法稱為治療性血管生成。α-SMA是由微血管的內(nèi)皮細(xì)胞周圍的周細(xì)胞特異性表達(dá)的一種收縮蛋白，可作為微血管生成的表面標(biāo)志物。 目前，國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于腦損傷后血管生成的報(bào)道：Beck等[7]研發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷后1 d即可出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增值，損傷3 d后可見腦血管數(shù)量明顯增加，提示腦缺血損傷后可即刻發(fā)生新血管的生成。有研究[8]顯示，缺血性腦損傷患者腦組織內(nèi)新生微血管密度存在不同程度的增加，且密度高血管組的預(yù)后明顯好于較低密度血管組，提示提高缺血性腦損傷患者腦組織內(nèi)新生微血管密度對(duì)提高患者預(yù)后具有重要意義。

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組和抑制劑組I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d各時(shí)間點(diǎn)的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；模型組、尼莫地平組和抑制劑組在本組內(nèi)后一時(shí)間點(diǎn)的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平前一時(shí)間點(diǎn)明顯升高(P<0.05)；與模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，尼莫地平組的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與尼莫地平組相同時(shí)間點(diǎn)比較，抑制劑組的α-SMA、PI3K及Akt陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。

本研究采用免疫組化法對(duì)老齡I/R大鼠微血管周圍α-SMA的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d的模型大鼠各時(shí)間點(diǎn)α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)水平均較假手術(shù)組顯著升高，且在I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d各時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，提示大鼠腦缺血損傷后為血管生成增加，其增加數(shù)量隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；尼莫地平組在I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d各時(shí)間點(diǎn)的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于模型組同期，提示尼莫地平可能通過藥物治療性血管生成模式促進(jìn)了大鼠缺血腦組織缺血區(qū)微血管的生成；而PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑組在以上各時(shí)間點(diǎn)的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)水平較尼莫地平組同期顯著降低，提示阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可減弱尼莫地平促進(jìn)缺血區(qū)微血管生成的作用，也從側(cè)面說明尼莫地平的促進(jìn)微血管生成的機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。

研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路是一條保護(hù)機(jī)體應(yīng)對(duì)各種刺激的重要通路，該通路激活后可通過調(diào)節(jié)其下游因子而調(diào)控細(xì)胞凋亡、生存及增殖，同時(shí)參與了腦缺血半暗帶區(qū)微血管生成和側(cè)枝循環(huán)的建立及腦I/R的生理病理過程[3-4]。PI3K作為一種具有脂類激酶和蛋白激酶雙重活性的酶，可被各種細(xì)胞因子激活，而進(jìn)一步誘導(dǎo)下游信號(hào)分子Akt 的活化[9]，在促進(jìn)心血管生成、調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡種起重要作用[10]。腦缺血后，機(jī)體大量上調(diào)PI3K和Akt的陽(yáng)性表達(dá)，啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)多種促內(nèi)皮生成因子的表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生和重塑，使缺血腦組織建立適應(yīng)性自我保護(hù)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，模型組I3 h大腦皮層PI3K蛋白表達(dá)量開始顯著升高，且I/R3 d、I/R3 d、I/R6 d 的陽(yáng)性表達(dá)量逐漸升高，PI3K蛋白的表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，說明腦組織在缺血急性期即啟動(dòng) PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以對(duì)抗缺血缺氧環(huán)境。尼莫地平組大鼠在I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d的PI3K蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平均較模型組顯著升高，而加用PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑后，PI3K蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平均較尼莫地平組顯著下降，提示尼莫地平干預(yù)可提高 PI3K蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平，起到腦保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可被抑制劑阻斷，說明啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是尼莫地平保護(hù)缺血腦組織的機(jī)制之一。同時(shí)，Akt在I3 h、I/R1 d、I/R3 d、I/R6 d各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)趨勢(shì)與 PI3K表達(dá)基本一致，此結(jié)果提示，尼莫地平可能通過誘導(dǎo) PI3K的高表達(dá)進(jìn)一步激活下游Akt的表達(dá)，通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通發(fā)揮促血管生成和缺血腦組織保護(hù)作用。

綜上，老齡大鼠I/R后，腦組織內(nèi)可見微血管生成標(biāo)記物 α-SMA 蛋白的表達(dá)，且隨著腦 I/R 時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMA 蛋白的表達(dá)量逐漸升高；尼莫地平對(duì)缺血腦組織的保護(hù)作用可能與提高腦缺血區(qū)α-SMA 、PI3K、Akt1的表達(dá)水平，激活PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。