血管生成擬態與Hif-1α、EphA2在原發性肝癌中表達關系的研究

李杰，馬曉潔，杜小波，譚榜憲

(1.綿陽市中心醫院腫瘤科，四川 綿陽 621000；2.川北醫學院附屬醫院腫瘤科，四川 南充 637000)

血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM) 是一種獨立于內皮細胞血管生成的全新腫瘤微循環模式。在缺氧微環境中，腫瘤細胞表達部分內皮細胞表型，模擬內皮血管生成途徑形成可以輸送血液的微循環管道，被稱為VM。過去十年針對VM的研究是腫瘤抗血管生成的熱點領域，關于VM的形成機制成取得不少成果，其中缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，Hif-1α)、上皮細胞激酶(epithelial cell kinase，EphA2)被認為調控 VM形成的兩個關鍵因子。本研究旨在探究VM與 Hif-1α、EphA2之間的關系，揭示VM形成機制。

1 材料與方法

收集川北醫學院附屬醫院、綿陽市中心醫院2010年至2014年PLC患者切除術后的蠟塊標本161例，所有病例臨床病理資料完整。蠟塊重新切片HE染色，明確分化程度、是否合并肝硬化；免疫組化染色觀察Hif-1α和EphA2的表達。鏡下選取5個不重疊的腫瘤細胞視野進行計數，根據陽性細胞數/細胞總數進行評分，陽性的細胞數<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分；染色強弱程度計分，無色：0分；淺黃色：1分；深黃及棕紅色：2分；棕褐色：3分。然后將染色強度×陽性細胞百分比對應的評分作為評分參考，0～3分為(-)；4分為(+)；5～8分為(++)；9～12分為(+++)，將≥4分者記為陽性。VM通過CD31-PAS雙染進行標記，管壁細胞CD31染色陰性且管壁外附PAS陽性的細胞外基質，管腔內有紅細胞為VM陽性。另外選取15例正常肝組織作為對照組，將正常肝臟組織進行CD31-PAS雙染。

統計分析采用SPSS 23.0軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，Logistic回歸模型進行多因素分析，相關性檢驗采用Spearman相關分析。雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLC中VM表達與各臨床因素的關系

PLC中VM陽性率為37.9%，正常肝臟組織中沒有VM表達?；颊卟煌挲g、性別、病理類型和HbsAg對VM表達比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。VM表達與腫瘤體積(>5 cm3或<5 cm3)呈正相關(χ2=4.590，P=0.032)；與臨床分期I-II和III-IV(AJCC/UICC第7版)呈正相關(χ2=5.022，P=0.025)；與HCC edmondson分級呈正相關(χ2=7.575，P=0.006)；與肝硬化呈正相關(χ2=8.284，P=0.004)。多因素回歸分析提示臨床分期、肝硬化是影響VM表達的獨立危險因素(P=0.020,P=0.012) 。見圖1、表1和表2。

表1 PLC中VM表達與各臨床因素的關系

臨床因素nVM (%)陽性陰性P值組別0.001 PLC組16162(38.5)99(61.5) 對照組15015(100.0)性別0.768 男性12247(38.5)75(61.5) 女性3914(35.9)25(64.1)年齡0.773 <60歲11444(38.6)70(61.4) ≥60歲4717(36.2)30(63.8)HBsAg0.865 陰性9937(37.4)62(62.6) 陽性6224(38.7)38(61.3)肝硬化0.004 無11636(31.0)80(69.0) 有4525(55.6)20(44.4)病理類型0.337 肝細胞肝癌13850(36.2)88(63.8) 膽管細胞癌156(40.0)9(60.0) 混合型肝癌85(62.5)3(37.5)臨床分期0.025 Ⅲ-Ⅳ期10446(44.2)58(55.8) Ⅰ-Ⅱ期5715(26.3)42(73.7)edmondson分級0.006 Ⅲ-Ⅳ級8137(45.7)44(54.3) Ⅰ-Ⅱ級5713(22.8)44(77.2)腫瘤體積0.032 <5cm35916(27.1)43(72.) ≥5cm310245(44.1)59(55.9)

表2 Logistic回歸模型進行多因素分析

2.2 Hif-1α和EphA2蛋白的表達

Hif-1α和EphA2蛋白主要在胞漿中表達，鏡下可見呈巢團狀分布，染色后呈棕黃色(圖2)。VM陽性組Hif-1α和EphA2陽性表達率分別為75.4%和80.3%，VM陰性組Hif-1α和EphA2陽性表達率分別為60.0%和63.0%，差異有統計學意義(χ2=10.608，χ2=8.490；P=0.014，P=0.037)(表3)。Spearman法相關性分析顯示EphA2與Hif-1α在PLC中的表達存在顯著相關性(r=0.194，P=0.014)(表4)。

表3 VM表達與EphA2、Hif-1α的關系

表4 EPHA2與Hif-1α相關性分析

VariablesEphA2-++++++r值P值Hif-1α-2319112+1414216++1010116+++28220.1940.014

3 討論

原發性肝癌包括肝細胞癌、肝內膽管上皮細胞癌以及兩者混合發生三種病理類型，根據2015年的統計數據，世界范圍內，肝癌致死率在所有惡性腫瘤中排名因第二[1]，是公認的嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。中國作為肝癌高發區，每年約有40萬人死于肝癌，病死率排在我國惡性腫瘤致死原因第二位[2]。PLC治療效果差是其高死亡率的主要原因，越來越多的研究者著力于探索新的治療手段，近年來抗腫瘤血管生成靶向治療成為了研究熱點，研究者對抗腫瘤學血管生成治療的領域進行了廣泛的探索，研發出多種抗血管生成治療的分子靶向藥物，如貝伐單抗、索拉非尼、阿帕替尼、恩度等藥物廣泛運用于臨床，但肝癌患者的總體療效未得到顯著改善。研究發現，惡性程度較高的侵襲性腫瘤[3-5]，除了經典的內皮細胞依賴性血管生成途徑以外，腫瘤細胞可以模擬內皮細胞表型形成網狀管道樣結構并與內皮依賴性血管相連而成的新生血管,這種血管形成途徑完全不依賴內皮細胞，被稱為血管生成擬態(VM)。VM由腫瘤細胞直接構成血管管壁，可為腫瘤的血性轉移提供更為便捷的途徑。因此探索VM的形成機制成為必要，以VM為靶標的治療策略成為近年抗血管生成治療研究的重點[6-7]。

15例正常肝臟組織進行CD31-PAS雙染，沒有觀察到VM表達。PLC的三種病理類型，VM總陽性率為38.5%。其中非肝細胞癌23例，VM陽性率40%以上，肝細胞癌VM陽性率36.2%。本研究中不同病理類型VM的表達，差異無統計學意義，由于非肝細胞肝癌樣本量少，不足以說明不同病理類型VM表達的是否存在差異，有待進一步研究證實。

研究表明缺氧微環境中Hif-1α的過表達是調控VM形成的重要因素[8]，而EphA2則是VM形成過程中重要的起始調節物[9]。本研究結果還證實了EphA2在Hif-1a高表達區呈強陽性,且與Hif-1a呈顯著正相關，腫瘤形成VM的能力顯著增加。研究表明RNA干擾抑制Hif-1a基因在食管鱗癌細胞中的表達,可在一定程度上降低EphA2的表達,抑制VM的形成[10]。調控機制可能是伴隨著腫瘤體積逐漸增大，腫瘤組織缺血缺氧，缺氧微環境誘導Hif-1表達增強，調節EphA2等基因的活性促進血管生成。一些可塑性強的腫瘤細胞分化和表達內皮細胞表型并模擬內皮血管結構形成VM,與正常血管連通,共同為腫瘤細胞生長提供營養，腫瘤組織重新獲得血氧供應。在本研究當中，腫瘤體積越大、腫瘤分期越晚VM陽性率越高，恰恰應證這種調控機制。腫瘤體積增大、臨床分期增加，腫瘤組織內部部分區域血供不足，出現缺血缺氧，缺氧微環境誘導VM的形成。此外，本研究中肝硬化能增強Hif-1α的表達，提示肝細胞癌合并肝硬化可加重低氧微環境的形成,其原因可能與肝細胞結節性增生、肝癌小梁細胞層增多和纖維結締組織過度增殖有關。因此不難理解，合并肝硬化的腫瘤組織中VM表達更強。

在多數實體瘤中，VM的形成改變了腫瘤局部微環境，增加了對腫瘤局部浸潤、微轉移的途徑，從而影響腫瘤患者的預后。本課題組前期回顧性研究發現證實VM表達陽性是原發性肝癌患者PLC預后不良的獨立因素[11-12]。本文主要討論VM的調控機制，關于VM對患者預后的影響需要更多的干預性研究來進一步說明。腫瘤發生發展過程中，離不開血液的供應，血液供應需要新生血管形成，而血管形成是一個多因素，多靶點的調控過程，VM的發現使研究者對腫瘤血管生成有了更全面的認識。近年的研究發現IL-6[13]、VE-cadherin[14]、Bcl-2和Twist1[15]在VM的調控機制中也發揮著重要的作用，但是目前對VM形成過程中的調控機制尚未系統的闡明，諸多疑問還需要分子水平的研究進一步回答。本研究選取石蠟標本，可能存在蛋白丟失，對結果造成影響，下一步將在術后新鮮肝癌組織進行進一步探索。