脫落乳牙牙髓干細胞與臍帶間充質干細胞治療大鼠脊髓損傷療效比較

劉露 張青 翟啟明 劉安琪 劉文佳 金鈁

目前對脊髓損傷(SCI，spinal cord injury)尚無有效的治療方法，細胞移植如胚胎干細胞、神經干細胞、雪旺細胞、嗅鞘細胞、間充質干細胞等為其帶來曙光[1]。由于存在移植物來源限制、 免疫排斥反應等問題，限制了前者的臨床應用；而間充質干細胞在此方面有明顯優勢，成為新的研究熱點。脫落乳牙牙髓干細胞(SHEDs)和臍帶間充質干細胞(UCMSCs)易于收集利用，越來越多關于其應用于脊髓損傷治療的研究[2-3],然而尚沒有研究比較二者的療效。

對于嚴重的脊髓全橫斷損傷，研究中常用的修復方法是干細胞復合外源性支架材料移植[4]，但支架材料的安全性及轉歸有待驗證。近年來一種基于細胞膜片工程的細胞聚合體技術作為組織工程的新秀引起大家的注意[5]。細胞聚合體含大量細胞外基質(ECM)內源性支架，更有利于細胞存活、增殖、分化，且制備簡捷， 已有部分關于細胞聚合體技術應用于心肌梗死、腎損傷、角膜損傷及牙周損傷等的治療[6-7]，本實驗擬探究間充質干細胞聚合體對大鼠脊髓全橫斷損傷修復的有效性，并對UCMSCs和SHEDs 2 種聚合體體外性能，體內療效進行對比，選出更為優勢的方法，為臨床脊髓損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養基、 DMEM培養基、 胎牛血清FBS、 膠原酶、 Hanks' 溶液(Gibco，美國)； 胰蛋白酶(Invitrogen, 美國)； 維生素C、 熒光標記的鼠抗人單克隆抗體 CD29、 CD90、 CD31(eBioscience,美國)； CD105、 CD34、 CD45(Biolegend， 美國)； CCK-8細胞活力檢測試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)； PCR試劑盒、 BDNF、 NGF ELISA檢測試劑盒(Raybiotech, 美國)。

1.2 SHEDs，UCMSCs的分離，培養及鑒定

SHEDs：從臨床獲取患者脫落的乳牙，PBS反復沖洗，無菌條件下取出牙髓，機械剪切加酶消化法制備成細胞懸液，離心后用含10%FBS及雙抗的α-MEM培養基重懸，接種于T25的塑料培養瓶中，待細胞長至80%～85%后正常傳代[8]。

UCMSCs：從公司獲得新鮮的人臍帶，在Hanks'平衡鹽溶液中清除臍帶血管,將間充質組織切成約0.5 cm3的小塊， 250 g離心5 min。除去上清，用無血清DMEM洗滌沉淀物，離心后吸除上清；分別在37 ℃先后用膠原酶和2.5%胰蛋白酶處理18 h， 30 min；然后加入FBS停止消化。將解離的間充質細胞進一步分散在10% FBS-DMEM中，直接用于培養或儲存在液氮中以備后用。

鑒定：鏡下觀察細胞形態。待傳至P4代時，選對數生長期的細胞進行流式鑒定。常規消化離心，PBS重懸，以200 μl分裝至1.5 ml EP管中，每管不少于1×106個細胞。除空白管外，每管分別加入2 μl熒光標記的抗人單克隆抗體CD29-FITC，CD90-PE, CD105-PE，CD31-PE，CD34-PE，CD45-PE，室溫避光孵育30 min，PBS洗3 次， 800 r/min×5 min， 最終以300 μl PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測。

1.3 細胞增殖能力檢測

用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測細胞增殖能力：在96 孔板中加入100 μl(2 000 個細胞)細胞懸液，孵箱內培養1～7 d后分別檢測。加CCK-8溶液后繼續孵育2 h,用酶標儀測定在450 nm處吸光度。

1.4 細胞聚合體的制備

將P5代細胞按3×105/孔接種于12孔板中，待細胞長至85%～90%時棄去原有培養液，加入含VC(50 μg/ml)的α-MEM培養基, 每2 天換液1 次， 3 d后肉眼可見白色膜狀結構，并隨時間繼續增厚。培養7 d后用鑷子輕輕撕下細胞聚合體[9]，部分用于動物實驗，部分切片做HE染色。

1.5 相關神經營養因子表達情況

1.5.1 RT-PCR SHEDs，UCMSCs培養至P5代,提取細胞總RNA，用PCR RT Master Mix反轉錄合成cDNA。用 CFX96 Real Time System在實時定量 PCR儀中完成擴增和檢測。

1.5.2 ELISA 收集培養細胞聚合體第3 天和第7 天時的細胞上清，分別用 BDNF、NGF的ELISA試劑盒(按說明書操作)進行檢測。

1.6 SHEDs和UCMSCs聚合體治療大鼠脊髓全橫斷損傷的動物實驗

動物實驗程序符合第四軍醫大學動物使用及管理委員會規定。

1.6.1 建模及實驗分組 建立大鼠脊髓全橫斷模型：180～200 g SD雌性大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后手術：去除T8-9椎板，暴露脊髓，顯微剪均勻剪除T9處一段脊髓組織，形成2 mm間隙[10]。 ①SHAM組(僅去除T8-9椎板,n=8)；②SCI only組(形成2 mm間隙，不治療,n=8)；③實驗組A：SHEDs組(在2 mm間隙內植入SHEDs聚合體，n=12)；④實驗組B： UCMSCs組(在2 mm間隙內植入UCMSCs聚合體，n=12)； 之后分層縫合。大鼠蘇醒后雙后肢癱瘓，拖行。術后1 周腹腔注射慶大霉素防感染(1 次/d)；按壓膀胱輔助排尿(2 次/d)直至自主排尿功能恢復。

1.6.2 觀察指標 ①行為學評分: 實驗大鼠分別在術后1～8 周每周進行行為學評分，采用BBB評分法評價大鼠脊髓神經運動功能恢復情況。將大鼠逐只放至開放場地中，每只5 min， 2 名實驗員進行盲評。 0-7: 關節是否動(髖，膝，髁；幅度，頻率); 8-14：腳掌能否著地，著地后能否運動，運動協調否; 15-18：腳尖能否抓地，腳尖與前進方向是否一致，前后肢運動是否協調; 19-21：運動時軀干穩定否，尾巴翹不翹。②組織切片觀察： 實驗動物于術后第8 周麻醉，經心臟灌注固定后取出損傷區脊髓組織(2 cm)，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色觀察脊髓損傷修復情況。

1.7 統計學分析

實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，兩獨立樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞分離培養與鑒定

分離培養的SHEDs，UCMSCs細胞有良好的貼附塑料培養皿生長特性，在鏡下呈長梭形，放射狀或旋渦狀排布(圖1A)。生長曲線：前5 d SHEDs增殖活力明顯高于UCMSCs(P<0.05)， 6～7 d進入平臺期(圖1B)。 通過流式細胞術鑒定表型，間充質干細胞表面標志物CD29, CD90, CD105為陽性表達，造血或內皮細胞標志物CD31, CD34, CD45為陰性表達(圖1C)。

2.2 細胞聚合體特征

用含VC的培養基誘導一周后，SHEDs，UCMSCs形成完整的細胞聚合體，表現為膜樣形態，可在培養皿的邊緣分離，并能用鑷子機械撕除大體觀見圖2。HE染色顯示聚合體由多層細胞構成，含大量細胞外基質;且SHEDs聚合體比UCMSCs聚合體厚見圖2。與CCK-8檢測細胞增殖結果一致。

圖1 SHEDs和UCMSCs培養與鑒定

2.2.1 RT-PCR BDNF, NGF, NTF3, GDNF等基因，在SHEDs細胞中表達明顯高于UCMSCs，有統計學差異(P<0.01)； bFGF, CNTF在UCMSCs高表達(P<0.05)(圖3A)。

2.2.2 ELISA 第3 天和第7 天時BDNF和NGF的分泌SHEDs均高于UCMSCs，有顯著統計學差異，尤其是第7 天時差異更明顯(P<0.01)。且隨時間延長，BDNF，NGF分泌量增多，第7 天SHEDs的NGF分泌量顯著高于第3 天(P<0.05)(圖3B)。

2.3 行為學評分

SCI組大鼠脊髓全橫斷損傷后，雙后肢完全癱瘓，BBB評分前2 周基本為0；隨時間延長，有一定程度恢復，但評分不超過3。SHAM組術后運動功能輕度受損， 3 周后基本恢復正常。SHEDs組和UCMSCs組與SCI組相比，均有明顯恢復，有顯著統計學差異(P<0.001; 2 組均從第3 周開始出現明顯恢復，至第7 周進入平臺期，最高評分分別達8 分、6 分； 且在第3、 4、 5、 7、 8 周時2 組BBB評分有顯著統計學差異(P<0.01)(圖4)。由此可見，SHEDs組比UCMSCs組療效好。

圖2 體外成聚合體誘導培養7 d后機械撕除大體觀及聚合體縱斷面 (HE, ×5)

Fig 2 Cell aggregates induced for 7 daysinvitroand mechanically teared into longitudinal sections of cell aggregates (HE, ×5)

圖3 SHEDs和UCMSCs神經營養因子表達

2.4 HE結果

與SCI組比，SHEDs， UCMSCs聚合體移植后有效減小損傷區域面積；且脊髓損傷區兩斷端逆行性損傷病灶大小：SHEDs組明顯小于UCMSCs組。高倍鏡下脊髓損傷后，在白質中可見大量空洞形成且有許多細胞碎片，SCI組空洞多且面積大，組織雜亂，SHEDs，UCMSCs組空洞小而密集(圖5a1～a4); 灰質中，神經元胞體退化凋亡，尼氏體崩解，但SHEDs組比UCMSCs組胞體損傷少，存留藍染的尼氏體數目多(圖5b1～b4)；損傷中心，分散的群落狀的星形膠質細胞(擁有巨大的細胞核及纖維狀細胞質和細小突觸)及成纖維細胞形成大量瘢痕組織，UCMSCs組的瘢痕組織更為致密(圖5c2～c4); 損傷區域大量炎癥細胞浸潤，SHEDs組炎癥浸潤面積較UCMSCs組小(圖5d2～d4); SHEDs組損傷區靠近脊髓斷端處可見類似脊髓組織樣結構生成，UCMSCs組可見成簇的細胞聚合體及周圍大量炎癥細胞浸潤帶，未見明顯的再生脊髓樣組織(圖5e4)[11]。

圖4 大鼠運動功能BBB評分

3 討 論

脊髓損傷是一類高發病率， 高致殘率的中樞神經系統疾病,嚴重影響患者生活質量，給家庭和社會帶來沉重負擔。脊髓損傷后機體經歷原發性損傷和繼發性損傷，造成不同程度的神經元和膠質細胞的壞死、凋亡，脫髓鞘，以及微環境對再生修復的抑制，膠質瘢痕對軸突再生的阻礙等，加上中樞神經系統的自我修復能力極差[1]，所以對脊髓損傷的修復任重道遠。目前臨床上對脊髓損傷常用的治療方法有：早期手術減壓，大劑量糖皮質激素及神經營養類藥物治療，理療等，但效果都不盡如人意，且不能實現真正的脊髓再生；而細胞移植有望實現神經再生，是一種很有前景的治療方式[4]。

a： 白質，神經纖維； b： 灰質，神經元胞體聚集區，尼氏體； c： 瘢痕組織； d： 損傷區域炎癥細胞浸潤； e： 再生脊髓樣組織

圖5 脊髓損傷修復的組織學觀察 (HE， ×200)

a： White matter， nerve fibers; b： Bray matter， neuron cell bodies, Nissl; c： Scar Tissue; d： Inflammatory infiltration in injured areas; e： Regenerative spinal cord tissue

Fig 5 Histological observasion of spinal cord injury after treatment in the groups (HE， ×200)

UCMSCs和SHEDs因具有良好的間充質干細胞特性，能分泌多種神經營養因子，可誘導分化為神經細胞，且有來源優勢，在脊髓損傷治療中有越來越多的應用[3-4，12]，但對于兩者的療效比較及相關機制研究較少。本實驗通過比較二者體外生物學特征及體內移植后的功能恢復情況，對此進行初步探討。

本研究實驗結果表明：SHEDs比UCMSCs有更好的增殖能力，RT-PCR顯示：與軸突再生密切相關的神經營養因子基因BDNF，NGF，NTF3,GDNF等，在SHEDs細胞中明顯高表達；而另外一些基因：bFGF，CNTF在UCMSCs細胞高表達。蛋白水平的檢測結果也相一致，SHEDs細胞分泌BDNF，NGF的能力明顯強于UCMSCs。

同時本研究創新性地利用細胞聚合體技術來修復脊髓損傷，減少了外源性支架的不利影響，便捷高效，體內移植療效與之前研究相當[3，12]，治療8 周后BBB評分高達8 分。HE結果也顯示損傷區域面積減小，瘢痕組織減少，并且SHEDs組出現疑似再生脊髓樣組織。細胞聚合體有干細胞龕的作用，細胞連接充分，大量細胞外基質為其提供營養物質，更利于細胞的增殖和分化[7]。SHEDs組療效優于UCMSCs組，可能因為SHEDs是神經嵴起源的細胞，已有大量研究表明其表達神經元及神經膠質細胞標志物，是治療神經損傷及退行性疾病的理想資源[13]。

本實驗通過對UCMSCs和SHEDs聚合體在增殖，神經營養因子表達及體內移植后運動功能評定和組織學觀察等方面的比較研究，發現二者以聚合體形式治療大鼠脊髓全橫斷損傷是可行的，并且很有效，SHEDs療效要優于UCMSCs，為臨床治療提供新思路。二者可能是通過旁分泌功能發揮作用，不過具體機制還有待進一步探究。