大鼠不同胚層來(lái)源成骨細(xì)胞生物學(xué)行為比較研究

陳玉玲 許雄程 江俊 陽(yáng)雪 吳玉銘 何夢(mèng)嬌 駱凱

報(bào)道顯示，頜骨與長(zhǎng)骨等不同胚層來(lái)源的骨組織存在位點(diǎn)特異性差異[1-2]。某些骨組織疾病如雙膦酸鹽骨壞死[3]、家族性巨頜癥[4]和副甲狀腺功能亢進(jìn)頜骨腫瘤綜合征[5]等僅見(jiàn)報(bào)道于頜骨。血管生成在骨改建過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，與骨組織的病理性改變?nèi)鏟aget病、骨質(zhì)疏松癥等密切相關(guān)[6-7]。成骨細(xì)胞(osteoblasts, OBs)由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，不僅參與骨組織的形成和礦化，還可參與骨組織血管化的調(diào)控[8-9]。當(dāng)前，有關(guān)不同胚層來(lái)源OBs間促成血管能力的差異還不明確。本研究擬通過(guò)培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細(xì)胞(mandibular osteoblasts, MOBs)與股骨成骨細(xì)胞(femoral osteoblasts, FOBs)，探討不同胚層來(lái)源OBs在成骨與成血管相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)方面的差異，為探討位點(diǎn)特異性骨疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，體重(100±20) g(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)準(zhǔn)則。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM低糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國(guó))；膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、茜素紅S(Sigma，美國(guó))；青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、MTT、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol?Reagent(Life Technologies，美國(guó))；熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；大鼠血管生成素-1、成纖維生長(zhǎng)因子-2 ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、 冷凍高速離心機(jī)(Heraeus，德國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)； 倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)；iMARK酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480，德國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 成骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉處死，參照文獻(xiàn)[10]方法，分離股骨和下頜骨，去除骨膜、骨髓、松質(zhì)骨、肌肉等組織，皮質(zhì)骨經(jīng)PBS清洗后剪成約1～2 mm骨塊。37 ℃ 0.25%胰蛋白酶消化10 min，DMEM培養(yǎng)液蕩洗，0.1%膠原酶繼續(xù)消化30 min，棄上清。繼續(xù)消化1 h，收集上清。1 500 g離心后棄上清，加入含10% FBS、 100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液重懸后接種于培養(yǎng)瓶，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 天更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)進(jìn)行消化傳代。選擇3 代以內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT檢測(cè) 以5×103個(gè)/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于96 孔板內(nèi)，接種第3、 7 天采用MTT比色法對(duì)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取2 組細(xì)胞各6 孔，每孔加入200 μl新鮮配制的MTT(5 g/L)，37 ℃孵育4 h后小心吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200 μl的二甲基亞砜，低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔492 nm處吸光度值(A)。

1.3.3 ALP染色 以2×104個(gè)/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于24 孔板內(nèi)， 1 d后更換成骨誘導(dǎo)液(含50 mg/ml 抗壞血酸、 2 mmol/L β-甘油磷酸鈉和10 nmol/L地塞米松的DMEM)[10]。成骨誘導(dǎo)7 d后用采用95%乙醇固定15 min，進(jìn)行ALP染色。

1.3.4 ALP活性檢測(cè) 以2×104個(gè)/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于24 孔板內(nèi)，于成骨誘導(dǎo)后第3、 7 天棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3 次，每孔加入200 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞，取50 μl的細(xì)胞裂解液，參照ALP檢測(cè)試劑盒操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔405 nm處A值。取同一孔細(xì)胞裂解上清液，參照細(xì)胞總蛋白試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白濃度。ALP結(jié)果用細(xì)胞總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.5 礦化結(jié)節(jié)檢測(cè) 以2×104個(gè)/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于24 孔板內(nèi)，連續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后棄培養(yǎng)液， 95%乙醇室溫固定15 min。1%茜素紅染液染色10 min，蒸餾水洗 3 次。 10 mmol/L磷酸鈉溶解的10%氯化十六烷基氨基吡啶室溫下洗脫10 min，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處A值。

1.3.6 熒光定量PCR檢測(cè) 以1×105/孔的密度將大鼠MOBs與FOBs接種于6 孔板內(nèi)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后棄培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，經(jīng)Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞ALP、RUNX2、I型膠原(collagen type I alpha 1, Col-Iα1)、骨鈣素(Osteocalcin,OC)、血管生成素1(angiopoiettin-1, Angpt-1)和成纖維生長(zhǎng)因子2(Fibroblast growth factor, FGF-2)的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。GAPDH上游引物為：CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG，下游引物為：ACGACATACTCAGCACCAGCATCACC；ALP上游引物為:CCTAGACACAAGCACTCCCACTA，下游引物為：GTCAGTCAGGTTGTTCCGATTC；RUNX2上游引物為：TCTGACTGGAAGAGCGGAGAG，下游引物為：GAGTGGGGAACACACAGGTCT；Col-Iα1上游引物為：TCTGACTGGAAGAGCGGAGAG，下游引物為：GAGTGGGGAACACACAGGTCT；OC上游引物為：TCCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC，下游引物為：GGCTCAGATAAGAGGGGTAAGAC；Angpt-1上游引物為T(mén)ATGGATGTGAATGAAGGAGGATGG，下游引物為ACTGCCTCTGACTGGTTATTGC；FGF-2上游引物為CTGGCTATGAAGGAAGATGGAC，下游引物為CGGTAAGTGTTGTAGTTATTGGAC。

1.3.7 ELISA檢測(cè) 以1×105/孔的密度將大鼠MOBs與FOBs分別接種于6 孔板內(nèi)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，收集培養(yǎng)液上清。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)培養(yǎng)液上清中Angpt-1和FGF-2的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及形態(tài)觀察

大鼠頜骨及股骨消化液接種至培養(yǎng)瓶， 1 d后即可觀察到個(gè)別散在成骨細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶底。 3 d后，細(xì)胞逐漸增加，呈梭形、紡錘形、三角形和多邊形(圖1A～1B)。7 d后，細(xì)胞匯合成層(圖1C～1D)。 倒置顯微鏡下MOBs與FOBs形態(tài)未見(jiàn)顯著差異。12～15d左右，細(xì)胞達(dá)90%融合，進(jìn)行傳代。

圖1 MOBs與FOBs原代培養(yǎng) (×100)

Fig 1 Primary culture of osteoblasts from mandible and femur (×100)

2.2 細(xì)胞增殖能力比較

MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞接種后3 d， MOBs的A值略高于FOBs，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；接種后7 d， MOBs的A值顯著高于FOBs(P<0.05)(圖2)。該結(jié)果提示MOBs的增殖能力優(yōu)于FOBs。

2.3 ALP染色及活性比較

成骨誘導(dǎo)7 d MOBs與FOBs的ALP染色均可著色， FOBs著色更深(圖3)。成骨誘導(dǎo)3、 7 d FOBs的ALP活性均顯著高于MOBs(圖3)，與染色結(jié)果一致。

圖2 MOBs與FOBs增殖能力比較

圖3 MOBs與FOBs ALP表達(dá)比較 (×40)

Fig 3 ALP activity comparison between MOBs and FOBs (×40)

2.4 礦化結(jié)節(jié)形成能力比較

成骨誘導(dǎo)14 d， 肉眼可見(jiàn)MOBs與FOBs均形成礦化結(jié)節(jié)。倒置相差顯微鏡下觀察，F(xiàn)OBs所形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量較多(圖4)。定量分析結(jié)果顯示MOBs礦化結(jié)節(jié)量顯著少于FOBs(圖4)。結(jié)果提示FOBs形成礦化結(jié)節(jié)的能力強(qiáng)于MOBs。

2.5 成骨相關(guān)基因表達(dá)比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)7 d， FOBs成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2、Col-Iα1和OC的表達(dá)均顯著高于MOBs(P<0.05)(圖5)。

2.6 成血管相關(guān)基因表達(dá)比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)7 d， MOBs成血管相關(guān)基因Angpt-1和FGF-2的表達(dá)顯著高于FOBs(P<0.01)(圖6)。

2.7 成血管相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)7 d，MOBs上清液中成血管相關(guān)細(xì)胞因子Angpt-1和FGF-2的表達(dá)均顯著高于FOBs(P<0.01)(圖7)，提示MOBs可產(chǎn)生更高水平的促成血管因子參與血管生成調(diào)控。

圖4 MOBs與FOBs礦化結(jié)節(jié)形成能力比較 (×40)

Fig 4 The comparison of mineralized nodule formation between MOBs and FOBs (×40)

圖5 MOBs與FOBs成骨相關(guān)基因表達(dá)

圖6 MOBs與FOBs成血管相關(guān)基因表達(dá) 圖7 MOBs與FOBs成血管相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)

Fig 6 Angiogenesis-related gene expression of MOBs and FOBs Fig 7 Angiogenesis-related cytokine expression of MOBs and FOBs

3 討 論

當(dāng)前，學(xué)者們對(duì)來(lái)源于外胚層的頜骨及來(lái)源于中胚層的長(zhǎng)骨細(xì)胞的比較研究主要集中在骨髓基質(zhì)細(xì)胞，頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力、體內(nèi)外成骨、成血管及其對(duì)自噬與凋亡的耐受均優(yōu)于長(zhǎng)骨來(lái)源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞[11-14]。OBs作為骨組織的主要細(xì)胞，在骨組織形成及改建過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。現(xiàn)有的針對(duì)不同胚層來(lái)源OBs間生物學(xué)行為差異的研究報(bào)道較少，且研究結(jié)果不一[15-16]。Lee等[15]人通過(guò)基因芯片檢測(cè)了不同胚層來(lái)源的人頜骨與髂骨OBs成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頜骨來(lái)源的OBs具有增殖能力強(qiáng)、成骨分化能力低的特點(diǎn)。Reichert等[16]則通過(guò)體外培養(yǎng)不同年齡山羊頜骨與脛骨的OBs，發(fā)現(xiàn)年輕山羊的MOBs增殖能力較低，而成骨分化能力較高。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠MOBs與FOBs，探討不同胚層來(lái)源OBs的生物學(xué)行為差異。研究結(jié)果顯示MOBs與FOBs相比，細(xì)胞的增殖能力更高，但反應(yīng)細(xì)胞成骨分化能力的指標(biāo)如ALP的表達(dá)、體外礦化結(jié)節(jié)形成能力以及成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2、Col-Iα1和OC的表達(dá)均較低。該結(jié)果提示來(lái)源于外胚層的MOBs與來(lái)源于中胚層的FOBs相比，細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng)但成骨分化能力較低。這一結(jié)果與Lee等人[15]的研究結(jié)論一致，但與Reichert等[16]的研究結(jié)果不同，究其原因，可能與不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境以及研究對(duì)象的不同有關(guān)。

在骨組織形成過(guò)程中，毛細(xì)血管的長(zhǎng)入在保證骨組織獲得充足的血供與營(yíng)養(yǎng)方面發(fā)揮重要的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，OBs可通過(guò)旁分泌成血管相關(guān)細(xì)胞因子(如Angpt-1和FGF-2)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞，但具體機(jī)制尚未明確[8-9]。Angpt-1可穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)血管形成過(guò)程中血管分支的形成[17]。FGF-2不僅可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，還可調(diào)控血管側(cè)支循環(huán)的形成[18]。有關(guān)不同胚層來(lái)源OBs間促成血管能力的比較目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次采用熒光定量PCR及ELISA比較了大鼠不同胚層來(lái)源OBs成血管相關(guān)細(xì)胞因子Angpt-1和FGF-2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比中胚層來(lái)源的FOBs，外胚層來(lái)源的MOBs表達(dá)更高水平的Angpt-1與FGF-2，提示MOBs有可能擁有更強(qiáng)的促成血管能力，該結(jié)論尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)大鼠不同胚層OBs間生物學(xué)行為比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中胚層來(lái)源的FOBs成骨分化能力較高，而外胚層來(lái)源的MOBs則表達(dá)較高的成血管相關(guān)細(xì)胞因子。結(jié)合以往研究報(bào)道[11-16]，可能與不同胚層來(lái)源的骨組織存在位點(diǎn)特異性有關(guān)。不同胚層OBs在表達(dá)成骨及成血管相關(guān)因子方面不同的具體原因，及該特點(diǎn)對(duì)不同骨位點(diǎn)OBs與內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用影響的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。對(duì)不同胚層來(lái)源OBs生物學(xué)行為差異調(diào)控機(jī)制的研究將對(duì)闡明骨位點(diǎn)特異性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療有所裨益。