紅花注射液對野百合堿損傷血管內(nèi)皮細胞NO活性、內(nèi)皮型NO合成酶及結(jié)締組織生長因子表達的影響

陳愛鳳 丁士標 林旭璦 孔亮亮 徐儉樸

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多種病因引起的以肺動脈壓和肺血管阻力進行性增高為特征的綜合征。肺血管收縮、重構(gòu)和原位血栓形成是PAH形成和肺循環(huán)血流動力學(xué)改變的基礎(chǔ)，持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致右心衰竭和死亡[1]。PAH的病理改變主要包括內(nèi)皮細胞的損傷和凋亡、中膜肥厚、炎癥細胞浸潤和肺小動脈血栓形成[1-2]。肺血管內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂在PAH的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用，表現(xiàn)為細胞一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase，NOS）分泌減少，結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、內(nèi)皮素-1和血栓素分泌增加[3-4]。目前的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法只能起到改善癥狀，提高生活質(zhì)量的目的，因此，亟需尋找更有效的治療方法。紅花是傳統(tǒng)的中草藥，其注射液由紅花提取精制而成，主要含有查耳酮類、漆樹黃酮、桑葉素、槲皮素、楊梅素等成分，具有抗氧化、抗凝、防止血栓形成、抗炎癥因子、抗氧自由基和擴張血管、調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖等作用[5]。本研究通過檢測紅花注射液對野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞（human vascular endothelial cells，HUVECs）損傷模型中NO、內(nèi)皮型NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、CTGF等形成的影響，探討紅花注射液對PAH的治療作用。

1 材料和方法

1.1 材料 MCT購自美國Sigma公司（批號：C2401-1G）。將 MCT溶于 1.0mol/L 鹽酸，用1.0mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，并調(diào)整濃度為20mg/ml。紅花注射液購自山西華衛(wèi)藥業(yè)有限公司（國藥準字Z14020008，批號：15010515）。抗eNOS多克隆抗體（批號：32027S）、抗β-actin單克隆抗體（批號：abs118937）、抗 CTGF 抗體（批號：86641S）購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。總NO檢測試劑盒（批號：S0024）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：RR047A），TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒（批號：RR820Q）購自大連寶生物科技有限公司。NO敏感性熒光材料二乙酰·二氨基熒光素（DAF-2/DA）購自美國Sigma公司（批號：FCANOS）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 HUVECs購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫，采用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。其中MCT組、紅花注射液組在初始培養(yǎng)時加入終濃度為1μmol/L的MCT，培養(yǎng)至細胞平鋪培養(yǎng)板底80%～90%后進行實驗。

1.2.2 細胞增殖分析 將1×105個/ml的MCT處理過的HUVECs接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，邊緣孔用滅菌PBS填充，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，根據(jù)前期預(yù)實驗，各孔加入終濃度分別為25、50、100、150、200μg/ml的紅花注射液，繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，參照CCK-8試劑盒說明書測定細胞在OD570時的吸光值，計算細胞增殖情況，每孔均重復(fù)3次并設(shè)MCT組為對照。細胞增殖抑制率（%）=（1-處理組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3 細胞內(nèi)NO檢測 根據(jù)參照文獻[6] ，實驗中設(shè)置未加入紅花及未加入MCT的細胞為空白對照組。空白對照組，MCT組、紅花注射液組加入終濃度為1μmol/L的 NOS激動劑乙酰膽堿（ACh）和NO敏感性熒光材料二乙酰·二氨基熒光素（DAF-2/DA），在室溫和37℃各孵育20min。激光共聚焦顯微鏡測定細胞在490nm和515nm的DAF-2熒光值，DAF-2熒光值的增加與NO濃度呈線性關(guān)系。

1.2.4 Western blot檢測 CTGF和eNOS收集培養(yǎng)的HUVECs細胞，用預(yù)冷1∶1的PBS緩沖液洗滌2次，加入100μl的細胞裂解液以裂解細胞，加熱變性后置于4℃保存。BCA法測蛋白濃度，各取50μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜2h，加入相應(yīng)的一抗和二抗，化學(xué)發(fā)光試劑增強反應(yīng)、X線片壓片、曝光。經(jīng)發(fā)光成像分析系統(tǒng)測光密度值。實驗中以β-actin蛋白量作為對照。

1.2.5 熒光定量PCR實驗 搜索Primer Bank，篩選HUVECs細胞適用的CTGF和eNOS熒光定量PCR引物（表1）。引物由上海Invitrogen公司合成。用酚/氯仿法提取以100μg/ml紅花注射液和（或）MCT處理的各細胞總RNA；以1μg的RNA為模版，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成 cDNA（37℃ 15min；85℃ 5s）；按照 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）試劑盒說明，以合成的cDNA為模板用480Ⅱ熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：變性95℃30s，1 個循環(huán)，PCR 反應(yīng)（95℃ 5s，60℃ 30s，40 個循環(huán)），熔解（95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃，1個循環(huán)），降溫（40℃ 30s，1個循環(huán)）；實驗中以β-actin作為對照。反應(yīng)完成后比對擴增曲線和熔解曲線，用2-ΔΔCt法計算RQ值。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示；組間比較采用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同紅花注射液濃度對HUVECs增殖的影響見圖1。

圖1 紅花注射液抑制MCT誘導(dǎo)的HUVECs增殖

由圖1可見，隨著紅花注射液濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用也越強（半數(shù)抑制濃度IC50為100μg/ml），紅花注射液對HUVECs細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。

2.2 各組HUVECs NO生成的DAF-2熒光值比較見表2。

表2 各組HUVECs NO生成的DAF-2熒光值比較

由表2可見，空白對照組在ACh處理后DAF-2熒光值明顯增加，MCT組DAF-2的熒光值明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而紅花注射液組的熒光值與空白對照組類似，亦增加明顯，顯著高于MCT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。2.33組HUVECs eNOS和CTFG mRNA表達比較見圖2。

圖2 3組HUVECs eNOS和CTFG mRNA表達比較

由圖2可見，與空白對照組比較，MCT組HUVECs的eNOSmRNA表達水平降低，而CTFG mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與MCT組比較，紅花注射液組eNOSmRNA表達水平升高，CTFGmRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 各組HUVECs eNOS和CTGF蛋白表達比較見圖3。

圖3 各組HUVECs eNOS和CTGF蛋白表達比較

由圖3可見，MCT組HUVECs eNOS蛋白表達水平下調(diào)，CTGF蛋白表達水平上調(diào)，而紅花注射液組eNOS蛋白表達水平上調(diào)，CTGF蛋白表達水平下調(diào)。

3 討論

PAH是極難治愈的低存活率疾病[7]，目前在PAH的研究中，多采用MCT處理的方法獲得病理模型[8]。MCT可以與血管內(nèi)皮細胞NDA形成交聯(lián)，抑制細胞增殖，導(dǎo)致炎性介質(zhì)如內(nèi)皮細胞乳酸脫氫酶和前列腺素等的釋放增加，血管滲出、水腫及形成血栓，從而導(dǎo)致PAH[9]。

紅花是我們國家的傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀消炎及防止血栓形成、擴張血管、調(diào)節(jié)心律等作用[10-12]，闡明紅花調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖及抗炎作用的分子生物學(xué)機制，可為指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。PAH是慢性阻塞性肺部疾病發(fā)展為心臟病的重要環(huán)節(jié)，雖然發(fā)病機制尚未完全闡明，但目前已有研究表明內(nèi)皮細胞損傷是PAH的起始環(huán)節(jié)，內(nèi)皮功能損傷引起肺血管過度收縮、肺動脈平滑肌細胞過度的分裂增殖，進一步導(dǎo)致血管收縮和血管舒張的生理平衡改變[4-5]。可見，保護肺血管內(nèi)皮細胞功能可有利于治療PAH。有研究提示肺動脈內(nèi)皮細胞是肌化的可能來源細胞，因此適當抑制其在PAH患者中內(nèi)皮細胞的增殖水平，對其肺血管重構(gòu)有積極意義。本研究進行了紅花注射液抑制人肺動脈內(nèi)皮細胞增殖的實驗，結(jié)果顯示隨著紅花注射液濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用也越強（IC50為 100μg/ml），并且呈濃度依賴效應(yīng)，但紅花注射液濃度過高造成貼壁細胞的大量脫落。上述試驗結(jié)果表明紅花注射液可抑制人肺動脈內(nèi)皮細胞的增殖。

NO是重要的血管舒張因子，對血壓的調(diào)節(jié)具有重要作用[13]。MCT可抑制細胞中NO的產(chǎn)生，從而使肺動脈收縮，加速PAH的形成。本試驗中，以MCT處理HUVECs，證明MCT可抑制NOS激動劑ACh導(dǎo)致的NO生成，而紅花注射液可以將該抑制作用降低，從而使NO的生成基本達到正常細胞水平。Western blot結(jié)果顯示，紅花注射液可減少野百合堿誘導(dǎo)的HUVECs中NOS蛋白表達降低程度，即紅花注射液可改善MCT對NOS基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程的抑制，并提高NOS mRNA的穩(wěn)定性，使NO合成增加，進而通過NO的增加抑制了細胞的有絲分裂和細胞增生。

有研究表明，在MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中，CTGF是組織纖維化過程中的重要分子，CTGF在肺組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高[14]，而高水平的CTGF導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白的大量沉積，最終導(dǎo)致動脈平滑肌細胞或內(nèi)皮細胞的重排[15]。本試驗亦證明MCT可誘導(dǎo)HUVECs表達大量的CTGF，而在紅花注射液的作用下，CTGF的高表達可被抑制。但具體的作用機制還需要進一步,深入研究。筆者認為紅花注射液可能通過改善動脈內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，減少炎癥的發(fā)生，擴張動脈，從而改善PAH患者的預(yù)后并降低病死率。