一種“裸眼”可視化檢測(cè)溶液的pH值及細(xì)胞中鐵離子的BODIPY類探針

渠星宇 邊永軍＊, 白 楊 沈 珍

(1晉中學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，晉中 030619)(2南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

鐵是人體血液中交換和輸送氧所必需的一種元素，體內(nèi)大部分鐵以離子形式分布在特殊的血細(xì)胞中[1]。人體中鐵離子含量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)帶來(lái)疾病，甚至死亡。因此，準(zhǔn)確及時(shí)地檢測(cè)生物體內(nèi)鐵離子的含量非常有意義[2]。目前檢測(cè)鐵離子的方法有很多，例如：原子吸收、耦合等離子質(zhì)譜法、電化學(xué)法、熒光分析法[3-6]等。熒光分析法作為一種新型發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、無(wú)破壞性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為一種十分實(shí)用的檢測(cè)方法[7-8]。但熒光分析法中有一個(gè)急需解決的問(wèn)題，即：需合成靈敏度高、選擇性好、溶解性好的熒光探針。硼氟二吡咯亞甲基(BODIPY)類熒光染料具有許多優(yōu)良的光物理性質(zhì)[9]，例如：摩爾吸光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，結(jié)構(gòu)易修飾等，已被廣泛地應(yīng)用到設(shè)計(jì)合成Fe3+熒光探針。2005年Bricks等[10]首次報(bào)道了一種熒光增強(qiáng)型的Fe3+熒光探針，即在BODIPY熒光染料的中位引入大環(huán)，發(fā)現(xiàn)該大環(huán)可以選擇性地與 Fe3+配合(配位比為 1∶1)。隨后，多種 BODIPY 類探針被合成并被應(yīng)用到檢測(cè)細(xì)胞中Fe3+的含量，即通過(guò)在BODIPY的母核中位引入羥胺基團(tuán)[11]、N-吡啶基 N-噻吩基胺基[12]、2-喹啉噻吩基團(tuán)[13-14]，利用光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)機(jī)理達(dá)到熒光強(qiáng)度改變的目的進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞中Fe3+的含量。此外，在BODIPY母核的3-，5-位引入對(duì)羥基苯乙烯基[15-17]、對(duì)磺酸基苯乙烯基[18]、席夫堿類基團(tuán)[19-21]，通過(guò)光誘導(dǎo)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)機(jī)理引起探針光譜性質(zhì)的改變，達(dá)到檢測(cè)Fe3+。

測(cè)定溶液pH值的變化對(duì)于許多領(lǐng)域都有非常重要的意義，這些領(lǐng)域包括化學(xué)、生物、工業(yè)生產(chǎn)等[22]。對(duì)于生物分析方面，設(shè)計(jì)合成pH探針，用于檢測(cè)生物細(xì)胞的變化、生理反應(yīng)過(guò)程等具有重要的意義[23]。 文獻(xiàn)報(bào)道，將(N，N-二甲基)胺基團(tuán)[24-27]或者苯酚基團(tuán)[28-29]作為pH值的識(shí)別基團(tuán)，引入到BODIPY母核的中位，利用PET原理達(dá)到檢測(cè)溶液及生物細(xì)胞中pH值的目的。文獻(xiàn)報(bào)道把嗎啡啉基團(tuán)[30-31]引入到 BODIPY 母核的 1-，7-或 3-，5-位或者2-，6-位，利用ICT或PET原理可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)溶液的pH值。

本論文選用熒光量子產(chǎn)率接近1的BODIPY化合物1作為熒光基團(tuán)，選用對(duì)羥基苯乙烯基團(tuán)作為功能基團(tuán)，合理的將功能基團(tuán)修飾到BODIIPY母核的3-位，得到探針2。盡管文獻(xiàn)曾報(bào)道[32]探針2通過(guò)化合物1和對(duì)羥基苯甲醛反應(yīng)得到，但是產(chǎn)率較低且沒(méi)有研究該化合物的光物理性質(zhì)。本文選用吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯代替對(duì)羥基苯甲醛，與化合物1反應(yīng)得到探針2，產(chǎn)率為39%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針2基于ICT原理，可以識(shí)別弱酸性溶液的pH值，也可以選擇性地檢測(cè)生物細(xì)胞中的Fe3+含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

所有的試劑均為分析純，用到的無(wú)水CH2Cl2在CaH2中回流并蒸餾得到。無(wú)水乙腈采用色譜純。三乙胺采用簡(jiǎn)單的蒸餾得到。

氫和碳的核磁共振圖譜均采用布魯克700 MHz核磁儀。高分辨質(zhì)譜采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL儀器。基質(zhì)輔助質(zhì)譜采用ultraflex TOF型儀器。吸收光譜采用TU-1901紫外光譜儀。熒光光譜采用Cary Eclips型熒光光譜儀。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)采用蔡司LSM880共聚焦激光掃描顯微儀。毒性試驗(yàn)采用ELX808酶標(biāo)儀。

1.2 合成探針2

探針2的合成路線見(jiàn)Scheme 1。化合物1由文獻(xiàn)報(bào)道的BODIPY類熒光染料經(jīng)典合成方法得到[14]。探針2采用Knoevenagel縮合反應(yīng)，選用吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯與化合物1反應(yīng)得到。

Scheme 1 Synthetic route for probe 2:わtriethyl formate and trifluoroacetic acid in CH2Cl2,triethylamine,DDQ,BF3·OEt2,r.t.;ぷ 3-formylphenyl picolinate,AcOH/piperidine,acetonitrile,reflux

探針2的合成方法：在100 mL的兩頸燒瓶中，加入 0.105 6 g(0.44 mmol)化合物 1，0.199 8 g(0.88 mmol)吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯，0.40 mL 無(wú)水哌啶，0.40 mL冰醋酸和50.0 mL無(wú)水乙腈。在氬氣保護(hù)下，使用分水器，加熱至沸，反應(yīng)過(guò)程用薄層色譜(TLC)監(jiān)測(cè)，至化合物1全部消失。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫。反應(yīng)液分別用水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到粗產(chǎn)物。柱層析分離，展開(kāi)劑用二氯甲烷，得到褐色固體，產(chǎn)率為39%。1H NMR(CDCl3，700 MHz)：7.47(d，J=7 Hz，2H)，7.45(d，J=21 Hz，1H)，7.21(d，J=21 Hz，1H)，7.01(s，1H)，6.83(d，J=7 Hz，2H)，6.66(s，1H),6.07(s,1H),5.46(s,1H),2.56(s,3H),2.29(s,3H),2.26(s,3H)。13CNMR(CDCl3,175 MHz)：156.77，156.00，154.58，140.85，140.48，136.44,135.00，133.70，129.40，119.03，118.49,116.83,115.87,115.46，14.97，11.58，11.54。 HR-MS(C20H20BF2N2O，[M+H]+)：計(jì)算值 353.163 6；實(shí)驗(yàn)值 353.163 0。

1.3 測(cè)試熒光量子產(chǎn)率

探針2的熒光量子產(chǎn)率測(cè)試條件如下，選用羅丹明6G為標(biāo)準(zhǔn)，溶解到乙醇溶液中(ФF=0.88)，濃度為1μm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)選用546 nm，熒光光譜的積分范圍為550～700 nm。熒光量子產(chǎn)率(Yu)的計(jì)算公式為：Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)(Gu2/Gs2)。Ys為羅丹明6G的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)u為探針2的熒光光譜積分面積，F(xiàn)s為羅丹明6G的熒光光譜積分面積，Au為探針2在546 nm處的吸光度，As為羅丹明6G在546 nm處的吸光度，Gu為探針2在不同溶液中的折射率，Gs為羅丹明6G在乙醇溶液中的折射率。

1.4 識(shí)別金屬離子的實(shí)驗(yàn)

將金屬離子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，F(xiàn)e2+)溶解到蒸餾水中，濃度為 1 mol·L-1。 Fe3+溶解到蒸餾水中，濃度為 0.2 mol·L-1。探針2溶解到甲醇和緩沖溶液的混合溶液中(V/V，1∶2)，濃度為10μmol·L-1。緩沖溶液選用醋酸與醋酸鈉配制的緩沖溶劑，pH為4.00。在滴定實(shí)驗(yàn)中，每次取用探針 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后采用微量進(jìn)樣器不斷加入Fe3+溶液。在選擇性實(shí)驗(yàn)中，取用探針 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后加入60μL其他離子。

1.5 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

HeLa細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所提供。HeLa細(xì)胞在37℃和5%(V/V)CO2條件下，于DMEM培養(yǎng)基(12%胎牛血清和1%抗生素)中培養(yǎng)。HeLa細(xì)胞貼在六孔板并孵育過(guò)夜，之后用PB(pH=6.00)溶液洗3次。探針2溶解到二甲基亞砜(DMSO)溶液中并加入到HeLa細(xì)胞中一起孵育并孵育30 min。探針2在培養(yǎng)基中的濃度為5μmol·L-1，多余的探針2用PB(pH=6.00)溶液清洗3遍，用作細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，取用1份相同條件下的HeLa細(xì)胞，采用上述方法加入探針2，之后補(bǔ)加100μmol·L-1的FeCl3于培養(yǎng)基中孵育1 h，PB(pH=6.00)溶液洗1次，用作細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物1和2的光譜特性

化合物1和2在二氯甲烷溶液中的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖和熒光光譜圖如圖1所示。化合物1和2均有經(jīng)典的BODIPY類熒光分子的吸收峰。探針2最大吸收峰位于573 nm，與化合物1相比，紅移了66 nm。化合物2的熒光峰位于581 nm，與化合物1相比，紅移了70 nm。主要原因是探針2在BODIPY母核的3-位引入對(duì)羥基苯乙烯基，增大了分子的共軛度。

圖1 化合物1和2在二氯甲烷溶液中的吸收光譜(實(shí)線)和熒光光譜(虛線)Fig.1 Absorption(solid line)and fluorescence(dash line)spectra of 1 and 2 in CH2Cl2

探針2在不同溶劑中光譜性質(zhì)如表1。從數(shù)據(jù)中可以看出，探針2的最大吸收峰和熒光峰沒(méi)有隨著溶劑極性的改變出現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。探針2在乙腈溶液中的最大吸收峰和發(fā)射峰的波長(zhǎng)最短，在DMSO溶液中最大吸收峰和發(fā)射峰的波長(zhǎng)最長(zhǎng)。探針2在不同溶劑中的熒光量子產(chǎn)率變化較大，在甲醇溶液中的熒光量子產(chǎn)率最高，為0.90。故而測(cè)試探針2對(duì)溶液pH值和Fe3+的響應(yīng)時(shí)均采用甲醇與緩沖溶液的混合溶液。

探針2在表1中的各種有機(jī)溶劑中的溶解度均良好，但不溶于水。為了選取合適的混合溶劑，測(cè)試了探針2在不同比例甲醇和水中的吸收光譜和發(fā)射光譜。探針2在純甲醇溶液中最大吸收峰和發(fā)射峰依次位于570和585 nm，隨著混合溶液中水的比例加大，最大吸收峰的位置沒(méi)有改變，但是強(qiáng)度在下降 (圖2a、b)。當(dāng)混合溶液中水的比例增大到67%(V/V)，探針2的最大吸收峰和發(fā)射峰的強(qiáng)度變化較小；當(dāng)水的比例大于67%(V/V)，探針2的最大吸收峰和發(fā)射峰的強(qiáng)度均有明顯的下降。同時(shí)，從拍照的圖片中可以明顯看到，無(wú)論是日光燈下還是在365 nm紫外燈下，混合溶液中水的比例應(yīng)該控制在 67%(V/V)及更小(圖 2c、d)。

表1 化合物2在不同溶劑中的光譜數(shù)據(jù)Table 1 Spectroscopic properties of compound 2 in different solvents at 298 K

圖2 (a)探針2在甲醇和水不同比例混合溶液中的吸收光譜圖;(b)探針2在甲醇和水不同比例混合溶液中的熒光光譜圖;(c)探針2在不同甲醇與水混合溶液中(0%～86%,V/V)的照片;(d)在365 nm紫外燈下探針2在不同甲醇與水混合溶液中((0%～86%,V/V)的照片F(xiàn)ig.2 (a)Absorption spectra of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents;(b)Fluorescence spectra of probe 2 in different CH3OH-water mixed solvents;(c)Photographs of the probe from CH 3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V);(d)Photographs of probe 2 from CH3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V)under UV lamp of 365 nm

2.2 探針2對(duì)弱酸溶液pH值的識(shí)別

探針2的吸收光譜和熒光光譜隨溶液pH值的變化曲線見(jiàn)圖3和圖4。探針2在不同pH值溶液中的吸收曲線表明，當(dāng)溶液的pH≤6.00時(shí)，溶液的最大吸收峰位于570 nm并且它的強(qiáng)度在酸性范圍內(nèi)隨著pH值的減小略有下降；當(dāng)溶液的pH≥7.00時(shí)，溶液的最大吸收峰位于600 nm并且它的強(qiáng)度在中性及堿性范圍內(nèi)隨著pH值的增大略有下降。同時(shí)詳細(xì)地測(cè)試了溶液pH值在6.00～7.00范圍內(nèi)，當(dāng)不斷加入NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值時(shí)，探針2在570 nm處的吸收峰不斷下降，同時(shí)在600 nm的吸收峰不斷升高。同時(shí)從圖片上可以清晰地看到，探針2在pH＜6.00時(shí)顯示粉紅色，pH值在6.00～7.00范圍，由粉紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，pH＞7.00為藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針2可以作為“裸眼”pH探針。

圖3 (a)在甲醇-水混合溶劑(67%,V/V)中,探針2在最大吸收峰處的吸光度隨溶液pH值變化的曲線;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下,探針2的吸收光譜變化;(c)探針2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片F(xiàn)ig.3 (a)Effect of pH value on the absorption intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Absorption spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)

圖4 (a)在67%(V/V)的甲醇和水混合溶液中,探針2在585 nm處的熒光強(qiáng)度隨溶液pH值變化的曲線;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下探針2的熒光光譜變化;(c)在365 nm紫外燈下探針2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片F(xiàn)ig.4 (a)Effect of pH value on the fluorescence intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Fluorescence spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)under UV lamp of 365 nm

探針2的熒光曲線隨溶液pH值的變化表明，當(dāng)溶液的pH≤6.00時(shí)，溶液的最大發(fā)射峰位于585 nm并且發(fā)射峰的強(qiáng)度在酸性范圍內(nèi)隨著pH值的減小略有下降；當(dāng)溶液的pH≥7.00時(shí)，溶液的熒光峰消失。同時(shí)詳細(xì)地測(cè)試了溶液pH值在6.00～7.00范圍內(nèi)，當(dāng)不斷加入NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值時(shí)，探針2在585 nm處的發(fā)射峰波長(zhǎng)不變，強(qiáng)度不斷下降。同時(shí)從圖片上可以清晰地看到，探針2在pH＜6.00顯示紅色的熒光，pH值在6.00～7.00范圍，紅色熒光在不斷消失，pH＞7.00時(shí)熒光完全消失。因此，探針2可以作為熒光探針用于測(cè)定溶液pH值。此外，利用Henderson-Hasselblad方程對(duì)滴定曲線進(jìn)行擬合(圖4b插圖)，結(jié)果表明探針2的p Ka約為6.05。

2.3 探針2對(duì)常見(jiàn)金屬離子識(shí)別

圖5 加入各種金屬離子后探針2在甲醇和緩沖溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光譜圖 (a)和熒光光譜圖 (b);在日光燈 (c)和365 nm的紫外燈 (d)下,探針2在不同金屬離子中的照片F(xiàn)ig.5 Absorption(a)and fluorescence(b)spectra of probe 2 upon addition of different metal ions in CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)mixed solution;Photographs of probe 2 upon addition of different metal ions under sunlight(c)and UV lamp of 365 nm(d)

探針2對(duì)常見(jiàn)金屬離子(Ca2+,Ni2+,Na+,Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+)的選擇性檢測(cè)見(jiàn)圖5。探針2溶解到甲醇和緩沖液(醋酸與醋酸鈉配制的緩沖液，pH=4.00)中，分別加入各種金屬離子，F(xiàn)e3+的加入量為探針2的400倍，其它金屬離子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，F(xiàn)e2+)的加入量為探針2的2 000倍，同時(shí)測(cè)試了該溶液的吸收光譜和熒光光譜圖 (圖5a、b)。吸收光譜圖表明，F(xiàn)e3+的加入改變了探針2的吸收光譜圖，最大吸收波長(zhǎng)由570 nm變化到505 nm，藍(lán)移65 nm；Mg2+的加入，使得探針2的吸光度略有下降；其它金屬離子的加入均沒(méi)有引起明顯的變化。同時(shí)從照片中(圖5c)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探針2溶液的顏色變?yōu)辄S色。熒光光譜表明，F(xiàn)e3+的加入改變了探針2的熒光光譜圖，發(fā)射波長(zhǎng)由585 nm變化到515 nm，藍(lán)移70 nm；Co2+，Cu2+的加入，使得探針2的發(fā)射峰的強(qiáng)度略有下降；其它金屬離子的加入均沒(méi)有引起明顯的變化。同時(shí)從照片中(圖5d)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探針2溶液在365 nm紫外燈下顯示綠色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針2對(duì)Fe3+的檢測(cè)具有選擇性，并且能夠在溶液中“裸眼”檢測(cè)出Fe3+的存在。

2.4 探針2對(duì)溶液中的鐵離子的識(shí)別

探針2的吸收和熒光光譜隨著Fe3+加入發(fā)生相應(yīng)變化曲線見(jiàn)圖6。吸收光譜圖及動(dòng)力學(xué)曲線表明，隨著Fe3+的加入量的增大，探針2的吸收波長(zhǎng)發(fā)生變化，570 nm處的吸光度在下降，505 nm處的吸光度在上升，當(dāng)加入400倍的Fe3+時(shí)，505 nm處的吸光度為最大。熒光光譜圖及動(dòng)力學(xué)曲線表明，隨著Fe3+的加入量的增大，探針2的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生變化，585 nm處的熒光峰在下降，515 nm處的熒光峰在上升，當(dāng)加入160倍的Fe3+時(shí)，515 nm處的熒光強(qiáng)度為最大(圖6d)。探針2與Fe3+的熒光動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖 6e，采用如下公式歸一化：R=1-Ii/Imax，Ii為探針2與Fe3+反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度，Imax為探針2未與Fe3+反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度。熒光反應(yīng)和Fe3+濃度的擬合曲線得到線性關(guān)系為y=0.495 3x-0.017 8，相關(guān)系數(shù)為0.991 4，可以計(jì)算出探針2檢測(cè)Fe3+的最低檢出限為0.36 mmol·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針2可以在溶液中檢測(cè)Fe3+的存在，并且探針2既是比率計(jì)量型的“裸眼”探針，又是比率計(jì)量型的熒光探針。

2.5 探針2對(duì)弱酸溶液pH值及Fe3+的識(shí)別機(jī)理研究

探針2與NaOH反應(yīng)前后的氫核磁譜圖見(jiàn)圖7a。探針2分子結(jié)構(gòu)中的3個(gè)-CH3化學(xué)位移值分別為2.49、2.32、2.28。 探針2與NaOH反應(yīng)后-CH3化學(xué)位移值為2.43、2.26、2.21。與未加入NaOH比較，化學(xué)位移值略有下降。同樣，探針2與NaOH反應(yīng)后苯乙烯基的化學(xué)位移值與探針2比較有較大的下降。參照文獻(xiàn)[29]，可以推測(cè)得到探針2在堿性條件下，3-位對(duì)羥基苯乙烯基失去羥基H質(zhì)子，變?yōu)檠踟?fù)離子。探針2與Fe3+反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7b。探針2的分子離子峰為352.155，探針2與Fe3+反應(yīng)后的離子峰為277.123。參照文獻(xiàn)[21]，推測(cè)出加入Fe3+后，探針2分子結(jié)構(gòu)中烯烴基團(tuán)斷裂，氧化為羧酸基。

圖6 加入不同濃度的鐵離子后探針2在甲醇和緩沖溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光譜圖(a)和熒光光譜圖(c);(b)探針2在570和505 nm處吸光度隨著加入不同濃度鐵離子的變化曲線;(d)探針2在515和585 nm的熒光強(qiáng)度隨著加入不同濃度鐵離子的變化曲線;(e)探針2與Fe3+反應(yīng)后歸一化的熒光強(qiáng)度隨Fe3+濃度變化的曲線Fig.6 Absorption(a)and fluorescence(c)spectra of probe 2 upon addition of Fe3+in mixed CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)solution;(b)Plot of absorbance vs Fe3+concentration at 505 and 570 nm;(d)Plot of fluorescence intensity vs Fe3+concentration at 515 and 585 nm;(e)Normalized fluorescence intensity of probe 2 after reacting with Fe3+as a function of Fe3+concentration

圖7 (a)探針2在氘帶甲醇中與NaOH反應(yīng)前后的氫核磁譜圖;(b)探針2與Fe3+反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖Fig.7 (a)1H NMR spectra of probe 2 in CD3OD before and after the addition of NaOH;(b)MSspectra of probe 2 before and after the addition of Fe3+

2.6 探針2檢測(cè)細(xì)胞中鐵離子

探針2在活體細(xì)胞中對(duì)Fe3+的成像見(jiàn)圖8。37℃下，探針2在HeLa細(xì)胞中孵育30 min，用530 nm的光激發(fā)，可以看到細(xì)胞有紅色熒光；用485 nm的光激發(fā)，沒(méi)有看到熒光(圖 8a、b)。補(bǔ)加 100 μmol·L-1的Fe3+到細(xì)胞中，孵育1 h，用530 nm的光激發(fā)，沒(méi)有看到熒光；用485 nm的光激發(fā)，可以看到細(xì)胞有綠色熒光(圖8c、d)。同時(shí)從明場(chǎng)和交疊場(chǎng)可以進(jìn)一步證明探針2可以檢測(cè)細(xì)胞中的鐵離子。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色強(qiáng)度比值較大(I2/I1＞20，圖9)，表明探針2主要染色到細(xì)胞質(zhì)上，細(xì)胞核染色較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針2具有較好的滲透性，可以很好地染色到細(xì)胞質(zhì)，并且能夠高效地檢測(cè)細(xì)胞中的鐵離子含量。

圖8 探針2在HeLa細(xì)胞中共聚焦熒光成像圖片、明場(chǎng)下圖片及交疊圖片:激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm(a)和485 nm(b)下,溫度為37℃時(shí)探針2在細(xì)胞中孵育30 min的圖片;激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm(c)和485 nm(d)下,溫度為37℃時(shí)細(xì)胞中補(bǔ)加100μmol·L-1的Fe3+孵育1 h的圖片;細(xì)胞在明場(chǎng)下的圖片(e,g);細(xì)胞在交疊下的圖片(f,h)Fig.8 Confocal fluorescence,bright field images and overlay images of probe 2 in HeLa cells:Cells incubated with 5 μmol·L-1 bright field of probe 2 for 30 min at 37℃upon excitation at 530 nm(a)and 485 nm(b);Cells supplemented with 100 μmol·L-1 of Fe3+in the growth media for 1 h at 37 ℃ upon excitation at 530 nm(c)and 485 nm(d);Bright field images of cells showed in panel(e,g);Overlay images of cells showed in panel(f,h)

圖9 (a)溫度為37℃時(shí)探針2在HeLa細(xì)胞中孵育30 min的共聚焦熒光成像圖;(b)分別單個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì) (1)、細(xì)胞核 (2)和細(xì)胞質(zhì) (3)所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度Fig.9 (a)Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells incubated with probe 2 for 30 min at 37℃;(b)Fluorescence intensity profile across the line shown in panel A corresponding to cytoplasm(1),nuclear region(2)and cytoplasm(3)

探針2對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)見(jiàn)圖10。不同濃度(0～60μmol·L-1)的探針2孵育到細(xì)胞中，結(jié)果表明，孵育5 h后，20μmol·L-1的探針2細(xì)胞存活率達(dá)到100%，探針2濃度加到60μmol·L-1細(xì)胞存活率降到83%。孵育10 h后，20μmol·L-1的探針2細(xì)胞存活率達(dá)到100%，探針2濃度加到60μmol·L-1細(xì)胞存活率降到78%。上述結(jié)果表明，探針2濃度在0～60 μmol·L-1，孵育 10 h，都不會(huì)影響細(xì)胞的生存，說(shuō)明探針2可以檢測(cè)細(xì)胞中的鐵離子含量。

圖10 探針2對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)Fig.10 MTT of probe 2

3 結(jié) 論

通過(guò)改進(jìn)Knoevenagel縮合反應(yīng)，將對(duì)羥基苯乙烯基引入到BODIY的3-位，增加了分子的共軛度，得到了熒光探針2。探針2易溶于常見(jiàn)的有機(jī)溶劑，具有大的摩爾吸光系數(shù)和高熒光量子產(chǎn)率(＞0.60)。探針2在甲醇-水的混合溶劑中隨溶液pH值的增大發(fā)生波長(zhǎng)紅移和熒光淬滅，可以作為“裸眼”探針檢測(cè)弱酸溶液的pH值。并且對(duì)溶液及活體細(xì)胞中的Fe3+表現(xiàn)出吸收和熒光光譜的比率計(jì)量型變化，且細(xì)胞毒性低，可以應(yīng)用在生物體系中Fe3+的檢測(cè)。