超高效液相色譜-質譜串聯法測定雙孢菇中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留量

朱衛芳 ，馬 琳 ，陳建波 ，趙 莉 *，占繡萍

（1.上海市青浦區食用農產品檢測中心，上海 201799；2.上海市農業技術推廣服務中心，上海 201103）

雙孢菇外表白嫩圓潤，味道鮮美，受到廣大消費者喜愛，是我國乃至全球食用菌生產中最大的菇種之一。近年來，雙孢菇市場行情看好，各地栽培面積不斷擴大，但線蟲等地下害蟲造成的危害也在逐年加重。線蟲主要生活在覆土層，以刺吸菌絲體造成菌絲衰敗，幼菇受線蟲侵害后，菌絲體變得稀疏，培養料下沉、變黑，發黏發臭，菌絲消失而不出菇，最終萎縮死亡。實地調查發現，不少種植戶使用噻蟲嗪、吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑防治土壤害蟲，但截至目前，尚未批準噻蟲嗪在土壤方面的登記使用。種植戶的超范圍使用對雙孢菇的質量安全造成潛在的安全風險。

研究表明，噻蟲嗪（thiamethoxam）在植物體內可轉化為噻蟲胺（clothianidin），因此JMPR評估報告中噻蟲嗪的膳食評估殘留物包括噻蟲嗪和噻蟲胺[1]。噻蟲嗪和噻蟲胺結構式見圖1。噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺的殘留測定方法主要有HPLC法[2]和LC-MS/MS法[3-5]。前處理方法大多采用固相萃取法（SPE）或QuEChERS方法。目前尚未見同時檢測雙孢菇中噻蟲嗪、噻蟲胺的方法報道。因此，研究建立高效準確，同時測定噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺的農殘檢測方法，對于保障食品安全，進行農藥安全評價具有重要意義。

圖1 噻蟲嗪（A）及噻蟲胺（B）的結構式

本研究采用改進的QuEChERS法，通過對樣品量和凈化條件等進行優化，并結合UPLC-MS/MS技術，建立雙孢菇中噻蟲嗪和噻蟲胺殘留的快速測定方法。本方法操作簡單，能夠滿足雙孢菇中噻蟲嗪和噻蟲胺殘留的快速檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器等實驗材料

1290超高效液相色譜、G6460三重四極桿質譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；水浴恒溫振蕩器SHA-C，常州國華電器有限公司。

噻蟲嗪（99.0%）、噻蟲胺（99.0%）標準品，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇（色譜純），德國Merck公司；PSA、C18，美國Agilent公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；甲酸（分析純），重慶川東化工有限公司。

雙孢菇、香菇樣品購于當地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相為乙腈＋0.1%甲酸水溶液（體積比95∶5）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為2 μL。外標法（峰面積）定量。

質譜條件：ESI源正離子模式電離，多反應監測（MRM）；氣體溫度：300℃；氣體流量：7 L/min；霧化器壓力：275.8 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11 L/min。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取5.0 g（精確至0.1 g）樣品至50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，冰浴超聲提取20 min，再加入2.0 g NaCl，渦旋1 min，并以3 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液轉入至裝有0.3 g無水硫酸鎂、50 mg PSA和40 mg C18的15 mL離心管中，渦旋1 min，并以3 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm濾膜，制成待測液。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

配制2種農藥標樣溶液（0.1 mg/L），并移取2 μL，以乙腈＋水（體積比50∶50）為流動相，采用電噴霧正負離子模式，對各農藥進行一級質譜掃描，確定農藥的母離子。對各個農藥的母離子進行二級質譜掃描，確定各農藥的子離子。最后結合基質空白和基質標樣溶液的離子掃描圖，進一步優化參數，確定2種農藥在多反應監測（MRM）模式下的質譜采集參數及質譜條件，結果見表1。圖2為0.1 mg/L雙孢菇基質標樣溶液的MRM離子色譜圖。

表1 2種農藥的LC-MS/MS檢測條件參數

圖2 2種農藥的UPLC-MS/MS色譜圖

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 稱樣量

QuEChERS方法中的稱樣量一般為10.0 g[6]。本實驗考察不同稱樣量（3.0、5.0、10.0 g）對2種農藥回收率的影響，實驗結果見表2。結果表明，樣品稱樣量過少或過多均會影響回收率。當稱樣量為5.0 g時，2種農藥的回收率均最佳。且隨著稱樣量的增加，溶劑等消耗增加，成本也會上升，因此，本實驗選取的最佳稱樣量為5.0 g。

表2 C18用量對回收率的影響

2.2.2 吸附劑選擇

PSA是QuEChERS法理想的凈化吸附劑。25 mg PSA可以完全吸附1 g含水量較高的水果、蔬菜提取液中的有機酸、糖類、極性色素等干擾物質，且對目標農藥的回收率影響可以忽略不計[7]。參考AOAC 2007.01方法，本研究中每mL提取液用25 mg PSA進行凈化吸附。

在凈化方法研究中，為了更好地去除樣品中的蠟質、甾醇、維生素等雜質，在添加25 mg PSA的同時添加不同用量C18（0、10、20、50、80和100 mg），研究結果見圖3。C18的加入能夠明顯降低蠟質、甾醇、維生素等雜質的干擾。當C18用量為20 mg時，2種農藥的回收率均較高，且用量繼續增加，2種農藥的回收率變化不明顯。因此，本實驗確定每mL提取液加入25 mg PSA和20 mg C18凈化劑。

圖3 不同C18用量對雙孢菇中2種農藥回收率的影響

2.3 基質效應

基質效應是由共洗脫基質組分引起的分析信號抑制或增強現象，已被廣泛研究并被認為是食品樣品LC-MS/MS定量分析中的誤差源[8-9]。本研究使用基質匹配的校準標準物來補償基質溶液中目標農藥的基質效應（Mi）。

Mi為正值，基質效應增強，反之減弱。當基質效應增強或抑制超過20%，則認為基質效應對定量檢測具有顯著影響，不可忽略[9]。雙孢菇中噻蟲嗪和噻蟲胺的基質效應分別為-25%和-31%，減弱效應比較明顯，均超過20%。為確保結果的準確性，本研究采用基質標準工作液為基準進行校正。

2.4 方法評價

2.4.1 線性關系與檢出限

在最優實驗條件下，對2種目標農藥的混合標樣溶液進行UPLC-MS/MS測定。以各農藥的質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算得到線性方程和相關系數，結果見表3。噻蟲嗪、噻蟲胺質量濃度為0.005～0.5 mg/L時，方法線性關系良好，相關系數分別為0.998 3、0.996 1。當實際樣品中2種農藥殘留量超過此線性范圍時，應對樣品溶液適當稀釋后再進行定量測定。在信噪比（S/N）為3時，2種農藥的檢出限（LOD）均為0.1 ng。

表3 方法的線性范圍及線性方程

2.4.2 回收率與精密度

分別在空白雙孢菇樣品中添加質量分數為0.005、0.01、0.5 mg/kg的混標溶液，每個添加質量分數平行測定5次，進行加標回收率實驗，結果見表4。2種農藥的平均回收率為85%～112%，相對標準偏差（RSD）為0.5%～7.1%。以最低加標濃度可知，2種農藥的定量限（LOQ）為0.005 mg/kg。結果表明，本方法具有較高的回收率和精密度，滿足農藥多殘留檢測要求。

表4 2種農藥的平均加標回收率和相對標準偏差（n=5）

2.4.3 方法應用

采用本文建立方法，對50份市售雙孢菇和香菇進行測定。結果顯示，1份雙孢菇中檢出噻蟲嗪，4份雙孢菇中檢出噻蟲胺，3份香菇中檢出噻蟲胺，質量分數為0.01～0.025 mg/kg，超過歐盟在栽培食用菌上的MRL值（0.01 mg/kg）。因此，食用菌中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留污染問題須引起監管部門的高度注意，防止發生因農藥殘留污染引起食品安全和環境污染問題。

3 小結

本研究采用優化的QuEChERS方法，結合UPLCMS/MS技術，建立了雙孢菇中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留的快速測定方法。方法操作簡單，其靈敏度、準確度、精密度均符合殘留測定要求，并能很好地消除干擾。此外，樣品的前處理簡便易行，極大地縮短了檢測時間，減少了有機溶劑使用量，便于實際操作。