新疆冬小麥過氧化物酶基因 TaPod-D1和 TaPod-A1的等位變異及分布

謝 磊，戰帥帥，王麗麗，任 毅，時 佳，耿洪偉

(新疆農業大學農學院/新疆農業大學生物技術重點實驗室,新疆烏魯木齊 830052)

面粉色澤是決定小麥品質的重要因素[1]，小麥籽粒過氧化物酶(peroxidase, POD)活性是影響面粉及面制品色澤的重要指標之一。籽粒POD活性與面團及面制品褐變程度高度正相關[2-3]，高POD活性可以提高小麥面粉及其產品的白度從而提高其商品價值。POD不僅能催化阿魏酸等主要酚酸的氧化，產生發色基團(如醌式結構)，使面粉中的無色前體物質形成有色物質，也能氧化降解面粉中的色素類物質(如類胡蘿卜素)，是面粉和面制品在加工和儲藏過程中發生褐變和黃色被漂白的主要原因[4-6]。同時，在面制品加工的面團混合過程中，POD催化所形成的產物在面制品烘烤過程中部分被破壞形成揮發物(如正己醛)，增加面制品香氣。籽粒中的POD是面包、饅頭和面條等面制品白度的重要影響因素[7]，與脂肪氧化酶(lipoxygenase, LOX)相比，POD能較少的破壞面制品風味，從而取代LOX作為主要的食品添加劑[8-9]。

環境與基因型均對POD活性有影響，但主要受遺傳因素影響[10-11]。前人根據水稻、玉米等禾本科作物基因共線性原理，對普通小麥POD基因進行QTL定位，結果表明，普通小麥POD基因位于第3和第7同源染色體上[12-13]。時 佳等[14]利用90K iSelect 芯片對黃淮麥區151份及北部冬麥區82份小麥品種的籽粒POD基因進行全基因組關聯分析(genome-wide association study，GWAS)，檢測到多個穩定遺傳的位點，分別位于2A、2D、5A、6A、7B和7D等染色體上。在檢測到的多環境穩定遺傳的位點中，2D染色體上的位點(97～100 cM)在3個環境中均能檢測到，是比較穩定的遺傳位點；7D染色體上位點的貢獻率最大，介于18.0%～21.4%之間，并針對7D染色體的POD基因開發了能應用于育種實踐的顯性互補標記POD-7D1與POD-7D6。POD-7D1 能在具有等位基因TaPod-D1a(與高POD活性相關)的材料中擴增出 540 bp 的片段，而在具有等位基因TaPod-D1b(與低POD活性相關)的材料中無擴增產物；POD-7D6 能在具有等位基因TaPod-D1b的材料中擴增出 640 bp 的片段，而在具有等位基因TaPod-D1a的材料中無擴增產物。魏景欣等[15]利用豆麥/石4185重組自交系(recombinant inbred lines，RIL)群體的214個株系和7 391個SNP標記及一個新開發的STS標記對普通小麥POD活性進行了QTL分析，共檢測到3個QTL；并針對3A染色體的POD基因開發了顯性互補標記POD-3A1與POD-3A2。POD-3A1能在具有等位基因TaPod-A1a(與低POD活性相關)的材料中擴增出 291 bp 的片段，而在具有等位基因TaPod-A1b(與高POD活性相關)的材料中無擴增條帶；POD-3A2能在具有等位基因TaPod-A1b的材料中擴增出 766 bp 的片段，在具有等位基因TaPod-A1a的材料中無擴增條帶。時 佳等[14]分別利用TaPod-D1和TaPod-A1位點開發的四對互補顯性功能標記，檢測兩個不同麥區的224份小麥材料的POD活性，并通過對比分析四個不同基因型組合平均POD活性間的顯著性差異，發現四個不同基因型組合的品種POD活性高低排列順序為TaPod-D1a/TaPod-A1b>TaPod-D1b/TaPod-A1b>TaPod-D1a/TaPod-A1a>TaPod-D1b/TaPod-A1a；并且含有兩個高POD活性等位基因TaPod-D1a/TaPod-A1b的品種(系)的POD活性顯著高于含有單個高POD活性等位基因TaPod-D1a或TaPod-A1b的品種(系)。

盡管目前已有許多和新疆小麥色澤與其他性狀關系(如多酚氧化酶、LOX活性等)及調控籽粒色澤有關基因的等位變異檢測及其在地方品種的分布規律的相關研究報道[16-20]，但迄今為止，對新疆冬小麥品種的POD基因TaPod-D1位點等位變異檢測以及兩個位點組合基因型檢測及分布規律的研究尚未見報道。本研究利用與POD活性相關的功能標記POD-7D1和POD-7D6及POD-3A1和POD-3A2，對98份新疆冬小麥品種進行分子標記檢測及分布規律的研究，以期為改良新疆小麥面粉色澤、選育高POD活性品種及分子育種奠定理論和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及其來源

供試材料為98份新疆冬小麥品種(系)，均由新疆農業大學農學院小麥課題組收集保存。其中，地方品種17份，引進品種(系)38份，自育品種(系)43份，這些材料基本反映了不同時期新疆冬小麥的育種現狀。

1.2 基因組DNA的提取

為避免因種子混雜而造成錯誤的檢測結果，本研究中每個品種均取3粒大小均勻、籽粒飽滿具有較好代表性的種子，提取基因組DNA。

1.3 PCR擴增及檢測

1.3.1 檢測引物

利用時 佳等[14]開發的顯性互補標記POD-7D1和POD-7D6檢測小麥7D染色體上TaPod-D1基因的等位變異，利用魏景欣等[15]開發的顯性互補標記POD-3A1和POD-3A2檢測小麥3A染色體上TaPod-A1基因的等位變異，具體見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 檢測POD基因的引物序列、擴增片段長度及其等位變異Table 1 Primer sequences, amplified fragments, and corresponding allelic variations of POD gene

1.3.2 PCR擴增與檢測

以小麥基因組DNA為模板，在Eppendorf AG PCR儀(Eppendorf，德國)上進行PCR擴增。PCR體系參考2×Es Taq MasterMix(Dye)說明書配制，除標記POD-3A2外，擴增程序參考2×Es Taq MasterMix(Dye)說明書進行，其中循環數為35，退火溫度為64 ℃(標記POD-7D1)或62 ℃(標記POD-7D6)或59 ℃(標記POD-3A1)。標記POD-3A2的擴增程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，由68 ℃開始，每個循環退火溫度均降低0.3 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環；最后72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在VILBER LOURMAT凝膠成像系統上拍照保存。

1.4 數據統計與分析

根據每個小麥品種的三粒種子DNA檢測結果判斷該品種的POD基因TaPod-D1和TaPod-A1位點等位變異類型，選擇PCR產物條帶清晰、單一且符合目標條帶大小的結果進行統計，若結果不一致，需重新提取該品種的其余籽粒DNA，進行檢測。

2 結果與分析

2.1 新疆冬小麥品種(系)的 TaPod-D1和 TaPod-A1等位變異類型及分布頻率

用顯性互補功能標記POD-7D1和POD-7D6及POD-3A1和POD-3A2對98份新疆冬小麥品種(系)進行分子標記檢測，結果(圖1、圖2和表2)表明，在TaPod-D1位點，98份新疆冬小麥品種(系)中，具有TaPod-D1b變異類型的材料有56份(占57.1%)，為優勢等位變異；在TaPod-A1位點，具有TaPod-A1a變異類型的材料有70份(占71.4%)，為優勢等位變異。也就是說，在兩個位點上，與高POD活性相關的變異類型(TaPOD-D1a和TaPOD-A1b)均為非優勢等位變異。

在新疆地方小麥品種、自育小麥品種(系)以及引進小麥品種(系)中，優異等位變異類型TaPod-D1a和TaPod-A1b(與高POD活性相關)的分布頻率均低于TaPod-D1b和TaPod-A1a變異類型，但TaPod-D1a變異類型在地方品種、自育品種(系)和引進品種(系)中是漸次升高的，TaPod-A1b變異類型在地方品種、自育品種(系)和引進品種(系)中也有漸次升高的趨勢。

a：用標記POD-7D1擴增的結果；b：用標記POD-7D6擴增的結果；M：Marker DL2000；1：邯5316；2：紅直頭/10；3：奎冬4號；4：新冬29號；5：新冬31號；6：唐山6898；7：奎花2號；8：石冬7號；9：新冬14號；10：奎花1號；11：伊農20；12：新冬23號。

a：用標記POD-3A1擴增的結果；b：用標記POD-3A2擴增的結果；M：Marker DL2000；1：濟南4號；2：F49-70；3：小鵝186；4：新冬20號；5：新冬24號；6：碧瑪1號；7：碧瑪2號；8：工農19；9：新冬21號；10：新冬22號。

表2 新疆冬小麥品種(系)中TaPod-D1和TaPod-A1位點等位基因的分布頻率Table 2 Frequencies of TaPod-D1 and TaPod-A1 in different types of winter wheat varieties

2.2 新疆冬小麥品種(系)的 TaPod-D1和 TaPod-A1等位變異組合類型及分布頻率

檢測結果(表3)表明，在98份新疆冬小麥材料中共出現4種等位變異組合，分別為TaPod-D1a/TaPod-A1a、TaPod-D1a/TaPod-A1b、TaPod-D1b/TaPod-A1a和TaPod-D1b/TaPod-A1b。

在地方品種和自育品種(系)中，優勢組合類型均為TaPod-D1b/TaPod-A1a，具有優異組合TaPod-D1a/TaPod-A1b的品種數均最少。在引進品種(系)中，優勢組合類型為TaPod-D1a/TaPod-A1a，具有優異組合類型TaPod-D1a/TaPod-A1b的品種數也最少。但優異組合類型TaPod-D1a/TaPod-A1b在地方品種、自育品種(系)和引進品種(系)中有漸次升高的趨勢。

在11份具有TaPod-D1a/TaPod-A1b等位變異組合的材料中，6個為自育品種(新冬14號、新冬24號、新冬27號、新冬33號、伊農21和新冬2號)，4個為引進品種(F49-70、阿芙樂爾、洛夫林18號和小鵝186)，1個為地方品種(麥洛瓦西)。這些品種可以作為高活性POD的優良種質。

表3 新疆冬小麥品種(系)中TaPod-D1和TaPod-A1位點等位變異基因組合類型的分布頻率Table 3 Frequencies of different allelelic combination on TaPod-D1 and TaPod-A1 gene loci in different types of winter wheat

3 討 論

時 佳等[14]利用TaPod-D1位點的顯性互補標記POD-7D1與POD-7D6檢測243份中國小麥材料，結果表明TaPod-D1a基因型所占比例較低。魏景欣等[15]、耿洪偉等[19]利用TaPod-A1位點的POD-3A1和POD-3A2功能標記檢測不同小麥材料，結果顯示TaPod-A1b基因型所占比例較低。本研究利用兩對功能標記POD-7D1和POD-7D6與POD-3A1和POD-3A2對98份新疆冬小麥品種(系)進行檢測，結果表明各位點的等位變異類型的分布與前人的研究結果基本一致，優異等位變異TaPod-D1a和TaPod-A1b類型的分布頻率也較低，這可能與新疆乃至全國的育種家在選育優質品種時以面筋強度為主要依據，對酶的特性考慮較少有關；新疆地方小麥品種中的TaPod-D1a和TaPod-A1b的分布頻率均為最低，可能與新疆早期育種對面粉及面制品顏色相關的性狀研究起步較晚，沒有施加足夠的選擇壓力，同時又缺乏對品種(系)POD基因型的認識相關。而新疆自育品種(系)中TaPod-D1a和TaPod-A1b的分布頻率介于新疆地方品種和全國品種之間，表明新疆早期小麥育種受地方品種的影響較大，導致高POD活性的TaPod-D1a和TaPod-A1b變異類型較少，近年來隨著外引力度加大，使得新疆冬小麥優異等位變異TaPod-D1a/TaPod-A1b得到提升。這一結果與新疆冬小麥早期品種多以地方品種為親本育成，近期品種則多以自育品種(系)和外引品種為親本所育的現狀相符。表明外來種質的引進改變了新疆小麥的遺傳組成，有力地推動了新疆小麥品質的遺傳改良。

此外，本研究僅對新疆冬小麥材料中控制POD活性位點7D及3A的等位變異進行了分子標記檢測，并未對其POD活性進行測定和關聯驗證，雖然在一定程度上可通過品種的POD基因型反映新疆冬小麥相應位點不同等位變異的分布和演化規律，但不能排除POD基因型相同而活性差異大的情況。今后，我們將進一步對新疆冬小麥品種(系)的POD活性進行測定，以期通過表型和基因型相結合對新疆小麥的POD活性進行綜合評價，為新疆小麥面粉和面制品色澤遺傳改良奠定基礎。