青鳉foxl2基因敲除突變體的構建與表型分析

周運迪，吳星星，趙海萍，羅大極

（1.武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430072；2.中國科學院水生生物研究所 淡水生態與生物技術國家重點實驗室，湖北 武漢 430072）

性腺分化（Gonadal differentiation）指動物性腺原基經一系列精確、程序化的發育，最終形成有生物學功能的精巢或卵巢的過程，是生命科學研究的核心問題，一直備受科研人員關注。魚類有極為豐富的物種多樣性和龐雜的性別決定方式，普遍存在顯著的兩性生長差異，生長是重要的經濟性狀，生殖是優良養殖品種培育和擴群應用的基礎，由此魚類的性別相關研究既關乎生長這一優良性狀又關乎品種繁殖。因此，魚類性腺分化與發育相關研究有深遠的基礎理論意義及廣泛的應用前景。青鳉（Oryzias latipes）作為一種重要的模式魚類，有胚胎發育易于觀察、易于顯微操作、適于基因編輯等特點。另外，青鳉屬于XX/XY型性別決定類型的魚類[1]，是第1種已克隆與鑒定雄性性別決定基因的魚類，其性別決定基因是DMY（也稱dmrt1bY）基因[2-3]，是研究性腺分化與發育的良好材料[4]。

FOXL2（Forkhead box L2）為Fox轉錄因子家族的重要成員[5-6]。最初，FOXL2基因在瞼裂病/眼瞼下垂/內眼角贅皮綜合征（Blepharophimosis/ptosis/ epicanthus inversus syndrome，BPES）患者中被克隆，隨后報道了部分BPES患者存在卵巢發育障礙[7-8]，提示FOXL2基因在性腺發育中的功能。研究顯示，敲除山羊Foxl2基因后突變動物的性腺會發生卵巢向精巢轉變[9-10]。小鼠Foxl2缺失導致卵巢早衰，卵泡的維持和粒層細胞發育異常，以及Dmrt1和Sox9等精巢發育與功能維持關鍵基因表達上升[11-13]。越來越多的研究顯示，Foxl2主要在哺乳動物的卵巢粒層細胞中表達，是卵巢分化和維持過程中的關鍵基因[14-15]。然而，foxl2基因在低等脊椎動物中的功能研究與相關機制研究尚少。受限于魚類基因操作技術，較長一段時間曾難以深入研究魚類中基因調控的分子機制，因此，青鳉foxl2基因研究主要集中在表達模式等方面[16-17]。

近年來，基因編輯技術發展迅猛，其中包括鋅指核酸酶技術[18]、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術[19]和規律成簇的間隔短回文重復序列基因編輯技術（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9），為基因功能研究提供了新方法[20]。其中，CRISPR/Cas9技術因操作簡單、成本較低、敲除效率較高和靶位點選擇性廣等優點而廣泛運用于各種動物基因編輯研究[21-23]。本研究用 CRISPR/Cas9技術敲除青鳉foxl2基因，建立青鳉foxl2基因突變體材料，為深入闡釋foxl2基因的功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

青鳉，Orange品系，由新加坡國立大學洪云漢教授贈予。在中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室培育，于 26 ℃下恒溫養殖，光暗周期比為14∶10。實驗按照中國科學院水生生物研究所實驗室的動物護理和使用指導原則進行。

1.2 foxl2基因CRISPR/Cas9靶位點設計

根據 CRISPR/Cas9靶序列設計網站信息（http://zifit.partners.org/ZiFiT/），設計foxl2基因敲除的靶位點。提交foxl2基因序列（NM_001104888.1）信息，通過網站獲得所有緊鄰5′ -NGG-3′ （PAM）的候選gRNA靶序列集合，選取青鳉foxl2基因起始密碼子ATG后評分最高的兩條gRNA在基因上的位置信息，進行體外合成和胚胎顯微注射試驗。

1.3 foxl2基因CRISPR/Cas9靶位點gRNA及Cas9 mRNA的合成

pT7-gRNA質粒和 pT3-Cas9質粒[23]購自Addgene。以pT7-gRNA質粒作為模板，設計PCR引物（表1），所用引物均在北京擎科新業生物技術有限公司（武漢）合成，擴增獲得攜帶 T7啟動子、foxl2基因靶位點序列和gRNA序列，PCR產物通過割膠回收純化，送鉑尚生物技術有限公司（武漢）測序，比對正確后，通過試劑盒（mMESSAGE mMACHINE? T7 Transcription Kit，Ambion，USA）體外轉錄合成，獲得foxl2基因靶位點和gRNA序列的 mRNA。pT3-Cas9質粒經限制性內切酶XbaⅠ酶切線性化后，通過試劑盒（mMESSAGE mMACHINE? T3 Transcription Kit，Ambion，USA）體外轉錄合成 Cas9 mRNA。將mRNA純化，測定RNA濃度，保存在- 80 ℃備用。

表1 引物及其序列Table 1 Primers and their sequences

1.4 青鳉胚胎的顯微注射

采用定量顯微注射系統（Warner PLI-100A，USA）[24]，將2個foxl2基因靶位點的gRNA分別與Cas9 mRNA以質量體積比（ng/μL）50∶500混合，分別注射青鳉一胞期的受精卵，每個位點注射不少于200枚受精卵，注射后胚胎在26 ℃下培養，用于后期檢測與傳代。

1.5 foxl2基因突變體的篩選與傳代

注射72 h后，隨機收集8枚青鳉胚胎，提取基因組 DNA，采用異源雙鏈分析法（Heteroduplex Analysis，HA）[25]檢測P0 代foxl2基因 CRISPR/Cas9靶位點的突變效率，PCR擴增后，測序驗證。注射胚胎發育為成體后，剪取少量尾鰭，通過HA法篩選出P0代中的突變個體。因為P0代的陽性魚是嵌合體，尾鰭檢測到foxl2基因突變，生殖腺中foxl2基因不一定突變；尾鰭與生殖腺中的foxl2基因突變類型也不一定相同。因此，將每一對 P0代的親本通過雌雄配對與野生型（Wild type，WT）交配獲得F1代群體獨立飼養。F1代發育成熟后，提取尾鰭DNA，PCR結合測序確定foxl2基因突變后的基因型，選擇突變類型為堿基缺失數目為非3整數的個體，造成foxl2基因編碼區發生移碼突變或提前終止翻譯的類型作為傳代的親本類型。選擇突變后基因型相同的父母本雜交獲得F2代群體，在F2代中篩選可獲得的foxl2-/-純合子個體和foxl2+/-雜合子個體，同理，產生 F3代群體，用于后續遺傳建系和實驗分析。

剪取少量尾鰭，提取基因組 DNA，通過 PCR擴增和測序分析foxl2基因突變體的基因型，并通過擴增DMY基因分析突變體的性染色體類型[26]。根據性別決定類型，青鳉為雄性異配型性別決定方式，即簡單表述為XX型雌性與XY型雄性。在F1代群體中檢測有野生型XX型雌性、野生型XY型雄性、雜合突變體XX型雌性（foxl2+/-）、雜合突變體XY型雄性（foxl2+/-）。在 F2代群體中檢測有野生型XX型雌性、野生型XY型雄性、雜合突變體XX型雌性（foxl2+/-）、雜合突變體XY型雄性（foxl2+/-）、純合突變體 XX型（foxl2-/-）和純合突變體 XY型（foxl2-/-）。

1.6 形態學分析

Orange品系青鳉雌性與雄性的背鰭與臀鰭形狀有顯著差異[26]，雄性臀鰭呈平行四邊形，雌性臀鰭呈三角形，通過觀察臀鰭形狀初步判斷成年青鳉的性別。將青鳉成魚麻醉，于體式鏡（Olympus SZ61，JPN）下拍照，統計并分析群體中雌雄比例。

1.7 組織學分析

按照中國科學院水生生物研究所和武漢大學實驗室動物的護理和使用指導原則對青鳉解剖與處理，將剖取的腺組織分成2份，一份放入Trizol試劑（Invitrogen，USA）用于提取 RNA，一份放入波恩氏液[V(苦味酸)∶V(甲醛) ∶V(冰醋酸) =15∶5∶1）]中固定 12 h，脫水，石蠟包埋，切片（切片厚度精巢6 μm，卵巢8 μm），蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹脂封片，于顯微鏡（Olympus BX53，JPN）下觀察、記錄與比較分析。

1.8 基因表達分析

提取 1.7中的性腺組織總 RNA，用 ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Toyobo，JPN）試劑盒反轉錄合成 cDNA。實時定量PCR反應體系（20 μL）： 2×SYBR Green Mix 10 μL，正、反向引物各 0.5 μL（終濃度 0.2 μmol/L），cDNA 模板 2 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，40 個循環；72℃ 15 s；繪制熔解曲線，65 ～ 95 ℃，5 s/0.5 ℃。β-actin為內參基因，用2-ΔΔCt法分析相關基因的相對表達[27]，通過GraphPad Prism 7軟件可視化作圖，相關基因的定量引物見表1。

1.9 數據統計分析

數據以平均值±標準誤形式表示，并采用SPSS18.0軟件對數據進行t-檢驗，0.01＜P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結果

2.1 青鳉foxl2基因敲除突變體材料的建立

青鳉foxl2基因敲除突變體材料建立流程見圖1。根據 CRISPR/Cas9靶序列設計網站確定青鳉foxl2基因候選CRISPR/Cas9靶位點，如圖2所示。通過提取DNA后PCR與測序的方法檢測F1代的突變類型（圖3），篩選出缺失4堿基基因型（Δ4 bp）的陽性魚作為親本，建立本研究的突變體材料。野生型FOXL2蛋白全長為306個氨基酸，Forkhead 結構域位于FOXL2蛋白的47至135位氨基酸，Δ4 bp突變型的foxl2基因預測僅可產生13個氨基酸的多肽鏈，在Forkhead結構域前終止（圖4），不能編碼全長FOXL2蛋白的氨基酸序列，提示foxl2基因Δ4bp突變型不具備正常功能。

圖1 青鳉foxl2基因敲除突變體材料的實驗流程Fig.1 Flow chart of generating foxl2 mutants in Medaka

2.2 青鳉foxl2基因純合突變體的篩選與表型分析

圖2 青鳉foxl2基因的結構示意圖Fig.2 Structure of foxl2 gene in Medaka

圖3 青鳉foxl2基因CRISPR/Cas9靶位點突變類型Fig.3 Target mutation type of foxl2 gene CRISPR/Cas9 in Medaka

圖4 青鳉foxl2基因缺失4堿基基因型的氨基酸序列預測與比對Fig.4 Prediction and comparison of the amino acid sequence of foxl2 gene with 4 base deletion in Medaka

選取foxl2-F和foxl2-R、foxl2-F1和foxl2-R1引物分別擴增F2代和F3代群體中每尾魚的foxl2基因，篩選foxl2基因突變的雜合子與純合子。圖5中，引物foxl2-F1和foxl2-R1 的PCR產物為497 bp，foxl2-F和foxl2-R的產物為322 bp，foxl2基因的PCR產物中，編號為2、4、5和8的樣品既有497 bp又有 322 bp條帶，說明該魚是野生型或突變型雜合子；編號為1、3、6和7號的樣品有322 bp但無497 bp條帶，說明該魚是突變型。為確認檢測對象的遺傳性別，通過擴增DMY基因判斷檢測對象的性染色體類型，DMY-F和DMY-R的 PCR產物為396 bp，即通過有無DMY基因PCR產物判斷是否攜帶Y染色體，從而判斷檢測對象的遺傳性別。如圖5所示，編號1、4和5號的青鳉為XX型性染色體，而編號2、3、6、7和8號的青鳉為XY型性染色體。

圖5 foxl2和DMY基因PCR擴增結果Fig.5 Amplification result of foxl2 and DMY gene

為進一步驗證foxl2基因突變型個體的基因型是否為純合子，對foxl2基因PCR產物測序，結果見圖6，驗證后的突變型純合子用于后續功能研究。進一步研究foxl2-/-突變體的生理性別是否與檢測的性染色體類型相符，foxl2-/-突變體的生理性別通過臀鰭形狀初步判斷，臀鰭呈三角形為雌性，臀鰭呈平行四邊形為雄性。統計結果見圖7。檢測野生型青鳉共計121尾，其中雌魚59尾，雄魚62尾，它們的生理性別與遺傳性別相符。然而，檢測的34尾foxl2-/-突變體遺傳性別無論是XX型還是XY型，其臀鰭形狀均顯示為雄性。各隨機取3尾foxl2-/-突變體，解剖后發現其性腺不具備典型的卵巢特征（圖7），提示foxl2-/-突變體的生理性別均為雄性。

圖6 野生型與突變型純合子的foxl2基因DNA測序Fig.6 foxl2 gene DNA sequencing of wild-type and mutant homozygous

圖7 野生型與突變型純合子性別比例統計Fig.7 Sex ratio statistics of wild-type and mutant homozygous

圖8 野生型與突變型純合子青鳉的表型Fig.8 Phenotypes of wild-type and mutant homozygous in Medaka

2.3 foxl2基因缺失對青鳉性腺的影響

獲得foxl2-/-純合子后，用組織切片分析foxl2缺失對青鳉性腺結構的影響（圖9）。與野生型青鳉卵巢和精巢比較發現，foxl2-/-純合子無論性染色體類型是XX型還是XY型，其性腺整體結構與精巢組織更為相似。值得注意的是，與野生型精巢不同，foxl2-/-純合突變體的精巢形態不規則，組織結構疏松，還發現極少數核仁外周卵母細胞和退化的核仁外周卵母細胞（圖9：1-8），表明foxl2缺失影響青鳉卵巢組織結構的維持。

精巢和卵巢在生殖細胞與支持性細胞類型上均有顯著差異，因此，進一步比較分析foxl2-/-純合突變體性腺組織中生殖細胞周圍的支持性細胞（圖9：9-16）。野生型青鳉卵巢中核仁外周卵母細胞周圍有一層緊密排列的長方形粒層細胞，野生型青鳉精巢中精小囊周圍有一些不規則三角形的支持細胞。著重觀察foxl2-/-純合子的性腺中核仁外周卵母細胞和支持性細胞類型，與野生型卵巢不同，雖然可觀察到極少數的核仁外周卵母細胞，但其周圍無正常形態的粒層細胞；同時，與野生型精巢相比，精小囊中各種精原細胞數目明顯減少，空腔顯著增多，值得一提的是，空腔周圍并無正常形態的粒層細胞。提示foxl2缺失可能主要影響青鳉卵巢組織結構的維持，特別是粒層細胞分化與功能的維持。

圖9 青鳉性腺組織結構Fig.9 Tissue section of gonad in Medaka

2.4 foxl2基因缺失對性腺分化與發育相關基因的影響

組織切片結果顯示，foxl2-/-純合突變體的性腺整體形態趨近于精巢，但精細結構尤其是生殖細胞周圍體細胞類型不同于精巢，表明foxl2-/-純合突變體性腺的分化與發育出現了紊亂。為從分子水平驗證這一推測，進一步用實時定量PCR檢測性腺分化與發育相關基因。選擇已報道的一系列與性腺分化與發育相關基因，其中精巢發育相關的基因sox9b、gsdf、amh以及卵巢發育相關基因cyp19a1a表達差異顯著（圖10）。為精細分析基因表達情況，充分考慮性染色體和基因組對基因表達的影響，將foxl2-/-純合突變體分為XX組和XY組，XX組表示性染色體類型為XX型青鳉性腺；XY組表示性染色體類型為XY型青鳉性腺。結果顯示，與野生型相比較，foxl2-/-純合突變體性腺中，sox9b基因的表達無論是XX組還是XY組均顯著升高（圖10A）；XX組的foxl2-/-純合突變體gsdf基因的表達顯著升高，XY組則無顯著差異（圖10B）；XX組的foxl2-/-純合突變體amh基因的表達增加極顯著，XY組則無顯著差異（圖10C）；XX組的foxl2-/-純合突變體cyp19a1a基因的表達降低極顯著，XY組則降低顯著（圖10D）。可見，foxl2-/-純合突變體性腺的基因表達情況均表現出精巢的分子特征，驗證了組織切片結果。

圖10 性腺中sox9b、gsdf、amh和cyp19a1a基因的表達分析Fig.10 Expression of sox9b, gsdf, amh and cyp19a1a gene in the gonad of Medaka

3 討論

FOXL2是Fox轉錄因子家族的重要成員[5-6]。隨著魚類基因編輯技術的發展與成熟，越來越多的研究聚焦到魚類Fox轉錄因子家族基因的功能。近期，通過建立foxl2基因敲除的羅非魚（Oreochromis niloticus）材料揭示，foxl2基因通過調控雌性信號通路的cyp19a1等關鍵基因影響性腺分化與發育[28-30]；斑馬魚（Danio rerio）中，存在foxl2a和foxl2b兩個同源基因，單獨敲除foxl2a與foxl2b基因后性腺表型變化不顯著，而雜交獲得的foxl2a和foxl2b雙敲除材料中卵巢發育受阻，提示斑馬魚foxl2a和foxl2b協同調控卵巢發育與維持[31]。隨著硬骨魚中對foxl2基因功能的研究逐漸深入，foxl2基因對魚類卵巢分化和維持的重要作用得以證實。

CRISPR/Cas9技術有操作簡易、敲除效率高和靶位點選擇性廣等優點。本研究利用CRISPR/Cas9技術敲除青鳉foxl2基因，建立了青鳉foxl2基因突變體材料，為后續深入闡釋foxl2基因功能提供良好的動物模型和研究基礎。主要圍繞foxl2基因缺失4堿基基因型（Δ4bp）的陽性魚產生的雜合突變型與純合突變類型開展了表型、組織切片與基因表達分析。因為雜合突變類型的表型不顯著，因而未在文中詳細展示與描述。對于純合子進行了 DNA和cDNA水平的檢測，通過三聯密碼翻譯預測驗證CRISPR/Cas9技術破壞了foxl2基因的正常翻譯，無法形成 FOXL2蛋白行使功能。因未獲得較好的FOXL2抗體，故未通過直接的實驗證明foxl2-/-純合突變體中無FOXL2蛋白。

序列比對發現，foxl2基因在魚類中比較保守。但羅非魚在受精后5 d檢測到foxl2基因的表達[32]，呂宋青鳉（Oryzias luzonensis）在受精后7 d（即孵化前1 d）檢測到foxl2基因表達[33]，然而青鳉在孵化后0 d檢測到foxl2基因表達[16]，可見不同魚類foxl2基因的時空表達不盡相同。因此，建立青鳉foxl2基因敲除的突變體材料有助于全面揭示foxl2基因在脊椎動物中的功能與分子機制。

本研究的性腺組織切片中，基因型為 XX的foxl2-/-突變體青鳉臀鰭等體征表現為雄性，即不具備典型卵巢特征而更像精巢，表明foxl2-/-突變體青鳉的性染色體與體征、性別存在不一致情況。為更精細揭示foxl2-/-突變體青鳉的表型，進行后續功能研究，本研究通過臀鰭等體征和性腺組織特征分別報道青鳉的性別，并通過擴增DMY基因判斷檢測對象的遺傳性別。由此，將foxl2-/-突變體青鳉分為XX型與XY型。檢測的34尾foxl2-/-突變體無論是XX型還是XY型的遺傳性別，其臀鰭形狀顯示其均為雄性，且解剖發現其性腺不具備典型的卵巢特征，提示foxl2-/-突變體的生理性別均為雄性。這與斑馬魚中雙敲除foxl2a和foxl2b[31]、羅非魚敲除foxl2報道突變體的雄性特征相似[29-30]。

本研究中，XX型的青鳉foxl2-/-突變體性腺整體結構上表現為精巢特征，但仍殘留少量的核仁外周卵母細胞和退化的核仁外周卵母細胞，提示 XX型的foxl2-/-突變體存在卵巢發育不全或者卵巢退化現象。在羅非魚和斑馬魚foxl2敲除個體中觀察到退化的卵母細胞和空腔，與本研究類似[29,31]。進一步觀察青鳉foxl2-/-突變體精巢，發現核仁外周卵母細胞周圍并無正常形態的粒層細胞，結合哺乳類與魚類的foxl2基因在性腺中的表達主要定位在粒層細胞[6,16,34]，提示青鳉foxl2基因的缺失導致核仁外周卵母細胞周圍的粒層細胞異常。而發生天然性逆轉魚類中foxl2的表達水平也隨著性別的轉換而發生卵巢粒層細胞與精巢支持細胞的改變[35-36]。本研究中，青鳉foxl2主要在粒層細胞及前體細胞中表達，為foxl2基因參與卵巢粒層細胞分化與功能的維持[16]提供又一佐證。

Sox9和Amh等與雄激素生成密切相關，直接影響性腺向精巢的分化與精巢的發育維持[37-38]，這從分子水平初步解釋本研究中青鳉foxl2-/-突變體性腺傾向于精巢的組織特征。大部分硬骨魚類中sox9基因有2種類型，即sox9a和sox9b/sox9a2[39-40]，性腺和精巢支持細胞中特異表達的是sox9b[41]。青鳉foxl2-/-突變體性腺中sox9b基因表達顯著增加，提示青鳉foxl2基因抑制sox9b表達，印證了哺乳動物中的相關發現[42]，foxl2-/-突變體sox9b、amh和gsdf基因表達升高也表明性腺向精巢方向分化的趨勢增強。Cyp基因家族是編碼芳香化酶P450的重要組分，與雌激素的合成密切相關。哺乳動物中的研究顯示，Foxl2可直接調控Cyp19a1轉錄，參與雌激素合成，影響性別的分化與性腺的發育[43]。青鳉包括cyp19a1a/cyp19a1和cyp19a1b/cyp19a2[44-46]。在青鳉中，cyp19a1a主要在性腺中表達，與性腺分化相關[47]。羅非魚的研究表明，foxl2可通過結合cyp19a1啟動子上的特異序列，激活cyp19a1的轉錄[28]。本研究中，foxl2-/-突變體中cyp19a1a的表達水平顯著降低，為突變體性腺雌性信號通路功能下降與卵巢維持功能下降提供了分子依據。青鳉cyp19a1a基因敲除研究也報道了突變體發育中出現卵巢向精巢方向的轉變[48]，但是，青鳉中foxl2是通過直接方式還是間接方式調控cyp19a1a，需進一步深入研究。

綜上所述，本研究通過CRISPR/Cas9技術建立了青鳉foxl2-/-突變體，發現青鳉foxl2-/-突變體出現遺傳雌性生理雄性的特征。foxl2基因的缺失造成cyp19a1a等雌激素信號通路相關基因的表達顯著下降，核仁外周卵母細胞退化和粒層細胞異常，卵巢功能退化；而sox9b、gsdf和amh等基因的表達顯著增加，foxl2-/-突變體性腺組織結構上更像精巢。初步闡釋foxl2在維持青鳉卵巢功能中的作用，為后續深入闡釋foxl2基因的功能提供良好的動物模型和研究基礎。