篤斯越桔花色苷提取工藝的研究

勾智麗

(扎蘭屯職業學院林業工程系，內蒙古 呼倫貝爾 162650)

篤斯越桔花色苷的提取方法主要包括溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等。溶劑提取法是應用最廣泛的方法，在破壞植物細胞壁和細胞膜的同時使花色苷溶出。微波和超聲波輔助提取法都是在溶劑提取法的基礎上輔以微波和超聲波的作用來提高提取效率[1]。這3種方法，所用的提取溶劑組成和配比種類很多，但是這些溶劑體系對越桔果實花色苷的提取效率未曾進行過系統的分析比較。為了更客觀地評價越桔果實中花色苷的含量和抗氧化活性，研究將致力于分析比較花色苷提取中的幾個關鍵點：破碎方式、溶劑體系和提取方式的選擇，然后對篤斯越桔花色苷的提取工藝進行優化。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 花色苷提取工藝原料 選用水濕地土型生境類型采摘的野生篤斯越桔果實作為原料，采集地點位于大興安嶺北部林區，地理坐標為124°25′ E，51°43′ N，海拔為512 m。在相同的立地條件下隨機抽取30株植株，每株采集3個結果穗，將采集的果實混合。

1.1.2 標樣 二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，試劑：甲醇、乙醇、鹽酸、乙酸均為分析純試劑。

1.1.3 使用儀器 SHA-CA型水浴振蕩器、JJ-2型組織搗碎機、UV-2800A型紫外分光光度計、DT5-2B型離心機、SL-N系列電子天平、QL-90型漩渦混合器、RE-52型旋轉蒸發儀、SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵、LGJ-19S型冷凍干燥機、JY99-IIDN型超聲波儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 花色苷含量的測定方法 采用示差法[2]，并略加改進。花色苷提取液分別與0.025 mol·L-1的NaCl緩沖液(pH=1)和0.4 mol·L-1的CH3COONa緩沖液(pH=4.5)以1/8(V/V)的比例混合，與NaCl緩沖液混合的樣品利用分光光度計在400～750 nm的波長范圍內掃描，用以確定其最大吸收波長λvis-max，每個花色苷提取樣品均在λvis-max和700 nm的波長下讀取吸光值。所有樣品在配制15 min后測定，并在1 h內完成。將吸光值換算為花色苷含量(TAC)，表示為每100 g鮮果中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(MGE)的含量(mg)。計算公式如下：

TAC=A×MW×DF×V×105/(ε×L×M)

A= (Avis-max-A700)pH1.0-(Avis-max-A700)pH4.5

式中：A—吸光值；MW—二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質量493 mol·g-1；ε—二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數21200；L—液層厚度1 cm；M—原料鮮果質量g。

1.2.2 果實破碎方式的確定 分別利用勻漿法和液氮研磨法對越桔果實進行破碎，比較分析兩種方法處理后果實花色苷提取效率。

勻漿法：將一定量的越桔果實放入組織搗碎機中，以物料沒過攪拌旋葉為準，勻漿10 min，取出勻漿的原料并混合均勻，從中稱取1 g放入50 mL三角瓶中，再加入10 mL不同的溶劑體系，放在水浴振蕩器內以250 rpm室溫下避光提取1 h，離心取上清液，測定花色苷含量。每次實驗均采用3個平行樣品。

液氮研磨法：液氮磨制樣品是分子生物學實驗中常用的方法，如果將其應用于活性成分的提取，不但可以消除高溫和氧氣的不利影響，還可以保證良好的均細度[3]。將一定量的越桔果實放入研缽，并在液氮中研磨，稱取1 g放入50 mL三角瓶中，再加入10 mL不同的溶劑體系，放入水浴振蕩器內以250 rpm室溫下避光提取1 h，離心取上清液，測定花色苷含量。每次實驗均采用三個平行樣品。

1.2.3 溶劑體系的確定 針對甲醇和乙醇系列溶劑提取花色苷的效率進行比較分析，包括甲醇(M)系列：M1-甲醇/水(65∶35，V/V)、M2-甲醇/水(80∶20，V/V)、M3-甲醇/水/乙酸(80∶19∶1，V/V)、M4-甲醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)；乙醇(E)系列：E1-乙醇/水(65∶35，V/V)、E2-乙醇/水(80∶20，V/V)、E3-乙醇/水/乙酸(80∶19∶1，V/V)、E4-乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)。精確稱取1 g以不同方式破碎的果實樣品，加入含有10 mL溶劑的50 mL三角瓶中，放在水浴振蕩器內以250 rpm室溫下避光提取1h，離心取上清液，分別測定花色苷含量。每次實驗均采用三個平行樣品。

1.2.4 提取方式和提取次數的確定 精確稱取1 g果實樣品(按選定方法破碎)，加入10 mL選定的溶劑體系，分別利用溶劑浸提法和超聲輔助提取法提取花色苷。溶劑浸提法：放入水浴振蕩器(250 rpm)內室溫下避光提取1 h；超聲輔助提取法：放入超聲波儀內避光提取20 min，離心取上清液。殘渣按上述方法再提取3次，分別測定花色苷含量。每次實驗均采用三個平行樣品。

1.2.5 篤斯越桔花色苷提取工藝參數優化 確定最佳的破碎方法、溶劑體系和提取方式后，對料液比、提取時間、功率等進行單因素試驗，最后通過正交試驗設計確定最佳提取工藝參數。單因素和正交試驗中每個試驗均重復3次。每次實驗均采用三個平行樣品。

1.3 統計分析

所得的實驗數據均以三個平行樣品的平均值±標準偏差來表示，利用Microsoft Excel 2007和SPSS 16.0進行數據統計分析。方差分析利用Student Newman Keuls法，置信區間為95%，圖表中表示的不同英文小寫字母表示同一項目的數據結果存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 破碎方式和溶劑體系對篤斯越桔花色苷提取效率的影響

不同破碎方式和溶劑體系提取所得的花色苷含量如圖1所示。無論用哪種溶劑體系進行花色苷的提取，篤斯越桔鮮果經液氮研磨后所得的提取液中花色苷含量明顯高于經勻漿破碎的樣品。與傳統的勻漿破碎方法相比，液氮研磨破碎平均可從鮮果中多提取花色苷36.59 mg·(100 g)-1，即增加了10%的提取率。主要原因一是液氮磨樣能保證良好的粒度均一性，且顆粒較細，二是花色苷對溫度敏感，機械破碎會產生的熱能使樣品溫度升高，導致花色苷部分降解，液氮研磨保證了樣品在低溫環境下破碎，可有效防止花色苷降解，并能保持其生物活性。Xu等指出液氮破碎處理可顯著提高葡萄果實中酚類物質的提取率[4]，對于藍莓鮮果，本研究也得到了相同的結果，由此說明在實驗室條件下液氮研磨預處理可顯著提高原料中生物活性物質的提取效率。

提取花色苷的溶劑經常為酸化甲醇或乙醇的水溶液。根據相似相溶原理，甲醇或乙醇與水混合的溶劑系統大于純的有機溶劑，當溶劑的極性增大到與花色苷極性相近時，可以溶解出更多的花色苷。而花色苷在酸性環境中更穩定，所以一般在溶劑體系中加入弱酸或強酸來降低pH值。在本試驗中，甲醇溶劑系統和乙醇溶劑系統對于花色苷的提取率并無顯著差異，M4-甲醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)和E4-乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)的提取率最高，液氮研磨后樣品提取液中花色苷含量分別為478.75和480.42 mg·(100 g)-1，而M1-M3和E1-E3溶劑系列的花色苷提取率不存在統計學上的顯著差異。這說明乙酸在提高花色苷提取效率上作用不明顯，而鹽酸卻起著重要作用，主要原因為等濃度鹽酸使溶劑體系的pH值變得更低，有效地保護了花色苷免受氧化和降解，從而提高了提取效率。由于提取得到的花色苷一般作為保健食品等的添加成分，考慮到安全性問題，我們在以下實驗中均采用E4乙醇溶劑體系。

2.2 提取方式和提取次數對篤斯越桔花色苷提取效率的影響。

提取方式和提取次數對花色苷提取效率的影響如圖2所示，總體來看，連續20 min超聲波輔助提取比連續1 h溶劑浸提(加以機械震蕩)的花色苷提取效率高，相同體積提取液花色苷的含量平均增加了26.72 mg·(100 g)-1。對于這兩種提取方法，第一次提取產量分別占總提取產量的91%和92%，重復提取三次均可達到最高產量，分別為513.54和539.56 mg·(100 g)-1，證明三次連續提取基本可將花色苷全部提取出來。超聲波主要利用其強大的空化相應、強烈的震蕩、較高的加速度等破壞植物原料的細胞壁，促使細胞中的內容物溶出，提高提取效率。但超聲輔助提取特別需要注意的是，長時間超聲作用產生的熱能可能使水浴溫度高于60 ℃，這會造成花色苷化合物的降解[5]，為了避免這一現象，在超聲波儀內的水槽中加入了一定量的冰塊，使水浴溫度一直保持在較低水平，來避免花色苷的降解。

圖1 不同破碎方式和溶劑體系對篤斯越桔花色苷提取效率的影響

圖2 不同提取方式和提取次數對篤斯越桔花色苷提取率的影響

2.3 超聲輔助提取篤斯越桔花色苷工藝優化

根據以上實驗結果，選擇乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)的溶劑體系進行超聲輔助提取篤斯越桔果實花色苷的單因素實驗和正交實驗，每次實驗都重復提取3次。

2.3.1 單因素實驗

圖3 超聲輔助提取篤斯越桔花色苷的單因素實驗(a.料液比；b.超聲功率；c.提取時間)

對于相同的原料質量，溶劑體積越大，花色苷的提取效率越高，主要原因是溶劑體積的增加能提高分子擴散速率并縮短平衡時間。花色苷的提取效率從1∶5料液比的366.97 mg·(100 g)-1升高到1∶30料液比的478.54 mg·(100 g)-1(圖a)。但從統計學上看，1∶20的料液比已經使篤斯越桔果實花色苷的提取效率達到了最高，再增加溶劑的體積(1∶25和1∶30)也沒有使花色苷的提取效率顯著提高。

超聲波產生的強烈震動和空化效應能夠使植物細胞內的花色苷分子快速溶解于溶劑中，提高提取效率。隨著超聲功率的升高，花色苷的提取效率也隨之升高，從400 W時的382.34 mg·(100 g)-1升高到800 W時的481.56 mg·(100 g)-1，但600 W、700 W和800 W的花色苷提取效率并不存在顯著差異(圖b)。

提取時間越長，提取越充分，提取時間為25 min時花色苷的提取效率為481.45 mg·(100 g)-1，已達到了最高，再延長提取時間，花色苷的提取效率也沒有明顯地升高(圖c)。張華等指出，花色苷容易發生氧化和降解，提取時間過長雜質會越多[6],所以超聲時間不宜過長。

2.3.2 正交實驗 根據單因素的實驗結果，超聲輔助提取篤斯越桔花色苷的三個因素料液比、超聲功率和提取時間分別選擇1∶20、600 W和25 min為中間水平，為了更準確地優化提取工藝，各因素水平的取值范圍也進行了適當的縮小。

微波輔助提取篤斯越桔花色苷的正交實驗設計表和結果如表1所示，由極差R可知，3個因素對提取效率影響的主次順序為料液比>超聲功率>提取時間。根據正交試驗結果分析得知，最佳提取條件為A3B3C2，即以1∶24的料液比、650 W的超聲功率和25 min的提取時間，提取3次，篤斯越桔鮮果的花色苷提取效率最高，為492.72 mg·(100 g)-1。

表1 超聲波輔助提取篤斯越桔花色苷的因素水平

3 小結

以大興安嶺地區采集的水濕地有土類型的野生篤斯越桔果實為試驗材料，對越桔果實花色苷的提取工藝進行研究。對影響越桔花色苷提取效率的幾個關鍵因素，即果實破碎方式、提取溶劑體系、提取方式和提取次數的分析結果表明：

(1)液氮研磨后越桔花色苷的提取效率明顯高于傳統的勻漿破碎處理；

(2)利用乙醇/水/鹽酸(80∶19∶1，V/V)溶劑體系提取花色苷的效率高且不存在安全性問題，連續3次超聲輔助提取的效果較好；

(3)對超聲輔助提取越桔花色苷工藝的優化結果表明料液比1∶25、超聲功率650 W和提取時間25 min時，經3次提取，水濕地有土類型篤斯越桔鮮果的花色苷提取效率最高，為492.72 mg·(100 g)-1。