鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達量的相關性分析

李 俊

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國東南部發病率較高的惡性腫瘤之一[1]，世界衛生組織2012年發布數據顯示鼻咽癌患病率約為1.2/10萬，而我國鼻咽癌患病率為1.9/10萬，每年因鼻咽癌死亡人數占全球鼻咽癌死亡人數的40.14%[2]。臨床治療該病的主要手段以外科根治術與放化療結合，患者治療后5年生存率在68.79%左右[3]，大部分患者死亡原因主要為術后腫瘤復發轉移[4]。而環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是近年來研究熱門的腫瘤相關因子之一，研究發現COX-2可通過抑制腫瘤細胞凋亡并促進腫瘤血管生成而導致腫瘤發生與轉移[5]；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通過加快血管內皮細胞增殖分化從而起到促進血管新生，在許多類腫瘤中均可發現該因子異常表達[6]；磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(Phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA)則被證實為一種宮頸原癌基因，但隨著對PIK3CA的深入研究發現乳腺癌、直腸癌等多種腫瘤組織中均有PIK3CA異常表達[7]。本研究通過探究鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達情況，分析三者間相互關系，并結合患者臨床資料探究上述指標對鼻咽癌發生發生的影響及臨床意義。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取我院2014年1月至2014年12月收治確診為鼻咽癌患者34例作為研究對象，入選條件：①入院時均經血液學、醫學影像學以及組織活檢確診為鼻咽癌，且病理診斷為鱗狀細胞癌；②活檢標本均為放射性治療前采集的；③所有患者均簽署知情同意書，且術后3年隨訪完整，剔除失聯病例。34例患者中，男性27例，女性7例，年齡28～76歲，平均年齡(57.89±21.55)歲，臨床分期情況：Ⅰ期6例、Ⅱ期10例、Ⅲ期9例、Ⅳ期9例。所有患者均行腫瘤根治術且術后根據個體實際情況行2～4個周期放化療及輔助化療治療。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑 鼠抗人PIK3CA單克隆抗體選購于Abnova公司；兔抗人環氧化酶-2多克隆抗體購自SATA，兔抗人VEGF多克隆抗體購自中山金橋，DAB試劑盒、馬抗小鼠HRP二抗、山羊抗兔HRP二抗選購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組織化學 活檢所取標本經10%中性甲醛固定后采用石蠟常規包埋呈3 μm厚的組織切片，收集所有患者組織切片后，采用常規免疫組化S-P法按照所購試劑說明書進行。一抗由PBS緩沖液代替作為以上染色的陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學結果判定 VEGF、COX-2、PIK3CA陽性表達的判定依據主要為細胞質、細胞核出現著色，利用裝有目鏡網格微側尺于200倍視野下進行計數，對5個網格中的蛋白表達陽性與陰性的腫瘤細胞數予以計數，根據所有腫瘤細胞總數中不同蛋白陽性腫瘤細胞占的百分率，對其進行相應的劃分，主要劃分標準為視野中陽性細胞數≥10%則為陽性(+)，<10%則為陰性(-)。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS20.0對本實驗所采集數據進行分析，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。VEGF、COX-2、PIK3CA表達之間關系采用Searson相關性分析方法進行分析，生存率用Kaplan-Meier法計算，VEGF、COX-2、PIK3CA不同表達組別的生存率關系用Log-rank檢驗分析。

2 結果

2.1 腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達情況與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系

鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達陽性率與患者性別、年齡均無顯著相關，而COX-2表達陽性率與患者是否發生淋巴轉移有關(P<0.05)，與患者腫瘤臨床分期無關(P>0.05)；VEGF、PIK3CA表達陽性率與腫瘤臨床分期及淋巴結轉移均有關系(P<0.05)，結果如表1所示。

2.2 鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達的相關性分析

34例鼻咽癌患者腫瘤組織中，VEGF表達為陽性的有25例，陽性率為73.53%；COX-2表達為陽性的有23例，陽性率為67.65%；PIK3CA表達為陽性的有25例，陽性率為73.53%，三者間陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。通過Pearson相關性分析鼻咽癌組織中的VEGF蛋白、COX-2蛋白表達量與PIK3CA蛋白表達量，發現前二者與后者明顯存在正相關關系(γ=0.808、γ=0.643，P均<0.05)。

2.3 鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達與預后相關性

鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達為陽性或陰性患者治療后第1年內存活率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，治療后3年，鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達為陽性患者的生存率明顯低于陰性表達患者(P<0.05)。見表2。

表1 鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達情況與患者臨床病理特征的關系(例，%)

表2 鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達與預后相關性(例，%)

3 討論

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，發病地區主要集中于廣東、廣西、湖南、福建和江西5個省份[8]，而鼻咽癌發病病因并不完全清楚，目前主要認為有基因遺傳因素、EB病毒感染、環境污染、長期接觸刺激性化學致癌因素等等[9]。鼻咽癌發病部位較為隱蔽且與顱底緊密相連，故鼻咽癌發病時極易侵犯顱底、頸動脈鞘區及咽旁間隙等周圍組織結構[10]，這給外科切除手術增加了難度。外科手術為了避開或與重要器官安全切緣往往難以完全切除腫瘤，這也是患者術后多出現腫瘤復發轉移而影響預后的重要原因之一[11]。但根治術后結合放化療可有效提高患者生存率，但放化療治療周期長，過程副作用多，部分患者難以堅持[12]。本研究通過探究鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達情況，分析三者間相互關系，并結合患者臨床資料探究上述指標對鼻咽癌發生發展的影響及與患者預后情況的相關性。

結果顯示鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達陽性率與患者性別、年齡均無顯著相關，而COX-2表達陽性率與患者是否發生淋巴轉移有關，與患者腫瘤臨床分期無關，說明COX-2與患者腫瘤發生轉移存在密切關聯，COX-2是機體內前列腺素合成過程中一個重要的限速酶，而前列腺素具有抑制細胞凋亡、促進細胞增生以及刺激新生血管生成等多種作用[13]。Zhu等[14]將104例低分化鱗癌NPC分為COX-2高表達組和COX-2低表達組，探討COX-2在低分化鼻咽癌中的表達及與頸淋巴結轉移的關系，發現有淋巴結轉移的患者COX-2比例明顯高于無淋巴結轉移者，多因素logistic回歸分析顯示COX-2高表達是鼻咽癌復發的危險因素。另一方面，VEGF、PIK3CA表達陽性率與腫瘤臨床分期及淋巴結轉移均有關系。VEGF是一種可以增加血管通透性、促進血管新生、引起淋巴管內皮增生的因子[15]，研究發現VEGF可能改變原有和新生的淋巴管內皮的通透性，以及腫瘤細胞和細胞外基質的黏附性，進而促進腫瘤細胞的轉移[16]。PIK3CA是近年來研究熱門的多種腫瘤相關原癌基因之一。Phipps等[17]研究發現10%～20%的結腸直腸癌細胞中出現PIK3CA突變；Scheffler等[18]亦發現非小細胞肺癌中PIK3CA基因異常活化后導致體細胞突變；Ma等[19]采用雙重PI3K-mTOR抑制劑BEZ235在體外對鼻咽癌腫瘤細胞進行誘導，發現該抑制劑可通過抑制AKT和mTOR信號通路誘導G1期阻滯和細胞凋亡；Yip等[20]通過對74例鼻咽癌患者腫瘤組織中PI3Kp110α和PIK3CA基因擴增后發現，腫瘤組織中PIK3CA基因的拷貝數明顯高于非惡性鼻咽組織中的，提示PIK3CA基因異常活躍導致正常細胞PI3Kp110α過度表達而導致鼻咽癌的發病。通過分析患者術后3年隨訪資料發現鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達為陽性或陰性患者治療后第1年內存活率比較，差異均無統計學意義，治療后3年，鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達為陽性患者的生存率明顯低于陰性表達患者的，說明上述3種因子均可預測患者術后長期生存情況，并且有可能可以根據這是3種因子的表達情況制定相應的術后放化療方案，避免不必要的醫療浪費。但本實驗所能選取實驗案例較少，該預后預測指標的預測準確性仍需進一步加大規模臨床實驗驗證。

由于上述3種指標在患者腫瘤組織中表達情況類似，且作用的方式也有異同之處，故我們猜想這三者存在某種生理病理學聯系，通過Pearson相關性分析鼻咽癌組織中的VEGF蛋白、COX-2蛋白表達量與PIK3CA蛋白表達量，發現前二者與后者明顯存在正相關關系，說明這三種作用因子可相互影響、相互作用，共同導致鼻咽癌的發生與發展，但應進一步對這三者生理病理聯系進行深入探究。