柳枝稷分蘗發育調控的生理生化機制研究

鄭愛泉， 徐開杰， 程亭亭， 張 超， 奚亞軍*， 孫風麗*

(1. 西北農林科技大學農學院， 陜西 楊凌 712100； 2. 楊凌職業技術學院， 陜西 楊凌 712100； 3. 中國農業科學院棉花研究所， 河南 安陽 455000)

禾本科植物分蘗是分枝的一種特殊形式，是產量的重要因素之一。其形成包括分蘗芽的起始和伸長兩個過程。研究分蘗芽伸長的調控因素可以為生產中提高分蘗數目和生物產量提供指導。分蘗芽伸長是非常復雜的發育過程，受到遺傳因素和環境因素共同調控，植物激素是遺傳調控和環境調控分蘗芽伸長的直接調節物質[1]。直接參與調控腋芽伸長的內源激素主要包括生長素、細胞分裂素和獨腳金內酯，其他激素如脫落酸、油菜素內酯和赤霉素等也通過激素之間的相互作用參與其中。環境因素包括營養成分(氮磷鉀等)、水分和光周期等，通過與不同激素的相互作用參與調控分蘗芽/腋芽伸長[2-3]。

生長素(3-吲哚乙酸，IAA)是研究最早的調控植物株型的植物激素之一。植物地上部分中，生長素在主莖莖尖和幼嫩葉片內合成，借助于PIN、AUX/LAX和MDR/PGP家族蛋白通過維管束向莖基部進行極性運輸，導致生長素在植株不同部位梯度分布,啟動下游信號轉導，對胚的發育、器官形成、側枝發育、側根產生、維管束發育及植物的向性等多方面具有重要作用[4-5]。細胞分裂素(Cytokinin,CTKs)對腋芽發育具有重要調節作用，可能作為生長素的第二信使直接促進腋芽的生長[6]。CTK含量上升可導致植物在發育后期呈現高度分枝的表型[7]。獨腳金內酯(Strigolactones,SLs)是最近被確認的一種新的植物激素，它是一種產生于植物根部的類胡蘿卜素衍生物，具有刺激寄生植物種子的萌發和促進叢枝菌根真菌菌絲分枝的作用，可以沿莖干向上運輸，與生長素和細胞分裂素一起直接或間接抑制植物分枝[8]。獨腳金內酯和生長素、細胞分裂素等其他激素以及環境因素等存在相互作用共同調控腋芽的伸長。其中獨腳金內酯與生長素的相互作用是目前研究較多的領域。獨腳金內酯與生長素在調控植物腋芽伸長發育中存在密切、復雜的相互作用，擬南芥max突變體中生長素對腋芽伸長的抑制作用降低[9]；獨腳金內酯可以調節生長素的運輸進而影響生長素對植物生長發育的調控作用[10]；生長素參與調節SLs的合成[9,11-13]。生長素和獨腳金內酯相互作用非常復雜，存在其他激素、環境等調節因素的參與。環境因素中的營養因素如氮(N)和磷(P)等影響植物腋芽的發育，研究發現氮和磷可能通過植物激素調節腋芽的發育，植物在低磷的環境下通過提高生長素受體TIR1的表達增加對生長素的敏感性[14]；同時低磷低氮影響植物的SLs合成及運輸[15-16]；生長素和獨腳金內酯信號途徑是氮調控植物分枝發育所必需的[17]。

柳枝稷是一種原產于美洲的多年生C4植物，適應性強，生物量巨大，環境適應性強，不占用作物耕地面積，是理想的能源作物之一[18-19]。能源作物年生物產量是重要的生產指標，分蘗數目直接影響柳枝稷的生物產量。分蘗芽分化形成后是否伸長決定了其是否發育成分蘗，柳枝稷分蘗芽的伸長決定了柳枝稷的分蘗數目和生物產量。本研究對一個EMS誘變獲得的少分蘗突變體進行生理、生化和分子生物學研究，探索柳枝稷分蘗伸長調控的調控機理，為提高柳枝稷生物量提供分子基礎和理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

柳枝稷品種Alamo經EMS(甲基磺酸乙酯)誘變所得少分蘗突變體lt，由本實驗室創制保存，該突變體材料利用無性繁殖方式保存。生長條件為光照16 h黑暗8 h、光照強度為12 000 lx。

瓜列當種子由西北農林科技大學馬永清研究員課題組惠贈。

1.2 實驗方法

1.2.1重力反應測定 通過無性繁殖得到的兩突變體小苗，在溫室小盆中培養15天后，旋轉90度，每兩天測量地上部分向上彎曲的角度。生長素抑制劑處理選擇2,3,5-三碘苯甲酸溶解(TIBA)在丙酮中，隨后加入蒸餾水至終濃度為10 μM。每2天加一次相同丙酮含量的自來水作為對照。

1.2.2去頂處理 大田種植的柳枝稷生長至主莖花序伸出時，去掉第一節，7天后測量腋芽伸長的長度。

1.2.3激素測定 激素測定實驗由南京鐘鼎生物技術有限公司測定，方法如下：

(1)激素提取

準確稱量約0.5 g新鮮植物樣品，于液氮中研磨至粉碎；向粉末中加入5 ml異丙醇/鹽酸提取緩沖液，4℃震蕩 30 min；加入 10 ml二氯甲烷，4℃震蕩 30 min；4℃，13 000 rpm離心5 min，取下層有機相；避光，以氮氣吹干有機相，以 400 μl甲醇(0.1%甲酸)溶解；過 0.22 μm濾膜，進HPLC-MS/MS檢測。

(2)液質檢測

用色譜柱(Poroshell 120 SB-C18反相色譜柱(2.1×150,2.7 um)；柱溫：30℃)吸附，流動相：A:B=(甲醇/0.1%甲酸)∶(水/0.1%甲酸)；洗脫梯度：0～2 min，A=20 %；2～4 min，A遞增至50 %；4～10 min，A遞增至80 %；10～11 min，A=80%；11.1 min，A遞減至 20 %；11.1～15 min,A=20 %，進樣體積為2 μl。質譜條件：氣簾氣：15 psi；噴霧電壓：4 500 v；霧化氣壓力：65 psi；輔助氣壓力：70 psi；霧化溫度：400℃

1.2.4瓜列當種子發芽 瓜列當種子用10%次氯酸鈉溶液滅菌3 min，無菌水洗滌3～4次，用70%乙醇洗滌1 min，無菌水洗滌3～5次，超凈臺晾干后待用。將瓜列當種子放置在加水的濾紙上在25℃的培養箱中暗培養3d。取柳枝稷根0.5 g用液氮研磨，加1 ml甲醇超聲處理30 min，離心取上清液。稀釋10倍后處理預培養的瓜列當種子，3 d后統計發芽率。

表1 不同激素的檢測條件Table 1 Tests of different conditions of the corresponding hormones

1.2.5RNA提取、反轉錄與定量PCR 取新發出的柳枝稷分蘗使用Trizol方法進行總RNA提取，使用Takara反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成。根據Primer 5.0設計定量PCR引物(表2)，按照熒光定量PCR試劑盒(Takara)使用說明，使用ABI Q7定量PCR儀進行實驗，利用其指定的軟件進行數據分析。

表2 定量PCR引物列表Table 2 The primers used in qPCR

1.2.6數據統計 文中測量數據利用Excel 2010做圖表，利用LDS法對各試驗數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 lt突變體分蘗能力減弱

與對照相比，lt突變體具有較弱的分蘗能力。突變當代lt突變體可產生有2個分蘗而對照含有36個分蘗。柳枝稷是自交不親和植物，突變體采用無性繁殖。無性繁殖后代的第一代lt突變體和對照相比分蘗能力依然較弱(圖1)。

2.2 去頂后lt突變體腋芽伸長速度減緩

柳枝稷莖節的腋芽一般處于休眠狀態，去掉莖尖頂端分生組織后，生長素對莖節腋芽的抑制作用解除，腋芽開始伸長。lt突變體去頂后所有腋芽的伸長速度與對照相比明顯降低(P<0.01)(圖2)。對照中從頂部向下的第一腋芽和第二腋芽的去頂后的伸長速度無明顯差異(P>0.05)，而lt突變體中第一腋芽伸長速度明顯高于第二腋芽伸長速度(P<0.05)(圖2)。這些結果表明lt突變體去頂后腋芽的伸長速度受到抑制。

圖1 突變體lt分蘗能力下降Fig.1 The tillering ability of the lt mutant was decreased注：(A)和(B)分別為對照ht和突變體lt刈割第二代表型，Bar=10 cm；(C)分別統計對照ht和lt突變體刈割后代的分蘗數；誤差線表示SEM；n=5. V0表示種子長出的當代；V1表示第一次刈割后長出的后代Note:(A) The phenotype of V1 from ht and lt. Bars=10 cm. (B) Statistics tiller number of vegetable generations from ht and lt separately. Error bars represent SEM;n=5. V0 means the seedling grow from the isolated buds. V1 means the second generation after cutting

圖2 去頂后突變體lt腋芽伸長受抑制Fig.2 The speed of axillary bud outgrowth in lt were inhibited after decapitation注：A去頂后腋芽的伸長B統計結果，1、2、3代表腋芽的從上往下的順序Note:(A) Photograph of auxillary bud outgrowth in ht and lt after decapitation. (Left:ht;Right:lt) (B) Statistical analysis of length of auxillary bud outgrowth at different shoot nodes in ht and lt

2.3 lt突變體的重力反應減弱

lt突變體地上部分的重力反應測定發現，lt突變體的重力反應較對照弱(P<0.01)(圖3A)。用生長素運輸抑制劑TIBA處理，二者的重力反應均變弱，但兩者之間的差異并未減少(P>0.05)(圖3B)。這些結果表明生長素運輸缺陷并不是導致lt突變體與對照向重力性反應差異的主要因素。

圖3 ht和lt莖的向重力性Fig.3 Shoot gravitropism in switchgrass ht and lt注：A.重力刺激下ht和lt的表型(左：ht；右：lt)箭頭指向代表重力方向，標尺為5厘米。B. 統計分析TIBA處理過和未處理過ht和lt莖的彎曲度.誤差線表示SEM，n=10，P<0.01 (ANOVA)Note:A.Photographs of ht and lt upon gravistimulation (left:ht;Right: lt) white arrow:direction of gravity. B.Statistical analysis of shoot curvature in ht and lt seedlings with or without TIBA treatment. Error bars represent SEM;n = 10,P<0.01 (ANOVA)

2.4 lt突變體中內源植物激素IAA和ABA含量增加

為了研究促進分蘗突變體形成的機制，用GC/MS方法測量了兩個突變體中赤霉素、脫落酸、生長素和細胞分裂素的含量。lt突變體中生長素和脫落酸的含量相比對照明顯升高(P<0.05)，赤霉素和細胞分裂素的含量與對照無明顯區別(P>0.05)(圖4)。由此推測lt中分蘗芽生長受抑制可能與生長素和ABA的高含量有關。

2.5 lt突變體獨腳金內酯(SLs)含量增加

獨腳金內酯(SLs)最近被確定為激素抑制分枝[20-21]。SL可以刺激列當種子萌發，植株根系提取物刺激列當種子發芽可以間接反映獨腳金內酯含量。結果表明lt突變體的根系提取物刺激列當種子發芽率高于ht對照，推測lt突變體中獨腳金內酯的含量高于對照，高含量的獨腳金內酯導致lt的分蘗發育受到抑制(圖5 A-E)。

圖4 突變體lt的植物激素含量變化Fig.4 Hormone levels in ht and lt mutant注：誤差線表示± SDs；n = 3. *代表ht和lt之間存在差異顯著(P<0.05,ANOVA)，**代表ht和lt之間存在極顯著差異(P<0.05,ANOVA)。Note:Error bars represent means±SDs;n = 3. *There were a significant difference between ht and lt (P<0.05,ANOVA). **There were a highly significant difference between ht and lt(P<0.01,ANOVA)

獨腳金內酯合成及信號轉導途徑的關鍵基因已經較為明確，水稻中D10、D17和D27參與類胡蘿合成SLs的過程，D14作為SLs的受體與D3、D53組成復合體，傳遞SLs的信號，對下游基因進行調控進而影響分蘗的發育。檢測ht和lt突變體中這些基因的表達量發現D3、D10、D14、D17和D27等在lt突變體中高于ht對照(P<0.01)。SLs信號途徑的抑制子D53在lt突變體中表達水平略低于ht對照(P<0.05)(圖5 F)。結果表明，lt突變體中SLs的合成和信號相對于對照增強，獨腳金內酯合成的增加是造成lt突變體分蘗數目減少的重要因素。

圖5 ht和lt中獨腳金內酯含量分析及相關基因的檢測Fig.5 Analysis of strigolactones content and expression level of related genes in ht and lt mutant.注：A-E為不同物質刺激瓜列當種子萌發。A.水；B. GR24；C. ht根際分泌物；D. lt根際分泌物；E. 統計分析；誤差線表示± SDs；n=3。ht和lt呈極顯著差異(P<0.01,ANOVA). 標尺為1 mm。F. 獨腳金內酯途徑相關基因在ht和lt中的表達量變化(Actin基因為內參)。**代表差異極顯著(P<0.01);*代表差異顯著性(P<0.05)Note：A. Water;B. GR24;C. Combined root exudates from ht plant;D. Combined root exudates from the lt mutant;E. Statistical analysis of germination stimulation on O. aegyptiaca seeds. Error bars represent means±SDs;n=3. There were a significant difference between ht and lt (P<0.01,ANOVA). Bars=1 mm;F. Relative expression level of genes involved in SLs. The ACTIN gene was the reference gene. **There were a highly significant difference between ht and lt (P<0.01,ANOVA). *There were a significant difference between ht and lt (P<0.05,ANOVA)

3 討論

分蘗芽伸長是由植物激素和環境之間的相互作用調控的，生長素由枝條頂端分生組織產生，通過極性運輸運送到基部，抑制腋芽的生長，而CK被向頂部運輸，同時促進腋芽生長，SLs同樣向頂運輸，但抑制腋芽生長[10]。ABA可以通過影響生長素合成和運輸來影響腋芽生長[22]。這些植物激素通過形成一個網絡來調控植物內部生長。柳枝稷的少分蘗突變體lt的獨腳金內酯、ABA和生長素含量均有所升高。定量PCR結果顯示參與SLs生物合成和信號途徑的基因表達水平存在差異。因此，柳枝稷分蘗芽的形成可能受上述植物激素的綜合調控。

水稻的SL信號途徑突變體能夠產生大量分蘗并且能夠增加突變體的向重力性反應。SLs水平降低會導致較低一側的莖基部生長素合成增加，從而增強了莖部的向重力性[23]。本研究發現，lt突變體中可能由于SLs的含量較高，導致SL信號途徑相關基因表達水平較高從而抑制分蘗芽的發育(圖5)。同時lt莖部的向重力反應較弱(圖3)，可能是由于lt突變體的SLs水平升高導致較低一側的莖基部生長素合成減少降低莖部的向重力性。但是lt中生長素的含量增加(圖4)，lt突變體植株地上部分的向重力性反應減弱可能是由于生長素分布異常導致的，但是生長素運輸抑制劑TIBA處理后并不能減少lt與ht對重力響應的差異，有待驗證生長素運輸相關的其他途徑。同時本研究中SLs含量檢測是用提取物刺激列當種子發芽進行間接測量的，需要更直接的方法檢測來進一步研究柳枝稷中SLs對分蘗的調控機制。

多年生禾本科植物柳枝稷能夠從位于莖節、根冠及根莖產生分蘗芽，在本研究中，突變體中分蘗芽的形成和伸長均受到抑制。柳枝稷為自交不親和植物，所以試驗中的突變體是種子通過EMS誘變產生后通過無性繁殖保存的，突變體與對照之間可能會有遺傳上的差異，即ht并不是嚴格意義的對照。同時我們發現突變體lt與對照ht之間的存在其他的差別，包括分蘗高度和莖稈直徑等方面，這可能是由于基因的一因多效造成的，也有可能是存在遺傳背景的差異，后期將在連續的生長期內對突變體調控分蘗的特殊機制做進一步研究。

4 結論

本研究對柳枝稷少分蘗突變體lt進行生理、生化和分子生物學研究，分析少分蘗突變體分蘗數目減少的原因。結果表明，突變體中的生長素、脫落酸和獨腳金內酯等植物激素含量的增加可能是其分蘗芽伸長發育受抑制的重要因素。本研究可為生產中提高柳枝稷分蘗數增加生物產量提供理論指導。