龍牧苜蓿種質資源耐混合蘇打鹽堿能力綜合分析

李 波， 方志堅， 張英俊， 李 紅， 劉瓔輝， 王玉玨， 張延琦

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 中國農業大學動物科學技術學院， 北京 100193；3. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院, 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生飼用豆科植物之一，具有豐產潛力大，營養價值高，適應性廣等特點，故被譽為“牧草之王”[1-2]。同時，苜蓿具有抗逆性強、耐瘠薄等特點，因此常用于改良土壤、改善生態環境等[3]。鹽害是限制苜蓿能否大面積種植的關鍵因素之一，苜蓿的耐鹽機制由特定基因型決定，且隨分化水平的變化而變化[4]。苜蓿生長發育過程中會受到不同程度的鹽堿脅迫，其中種子萌發期是植物鹽害最敏感時期，植株長勢是否優良取決于不同苜蓿品種間鹽敏感性差異，因此許多學者更加注重耐鹽苜蓿種質資源的篩選和優良品種的選育[5-7]。本文以5份龍牧系列苜蓿種質資源為材料，并對其進行不同濃度的混合蘇打鹽堿脅迫，分析各苜蓿品種萌發指標和芽苗指標的變化，同時運用主成分分析和模糊數學隸屬函數分析法進行綜合評價，建立苜蓿萌發期耐鹽堿綜合評價體系，為苜蓿耐鹽品種的選育、改良鹽堿化土地、提供優質蛋白飼料和鹽堿地畜牧業的發展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苜蓿龍牧系列種子由黑龍江省畜牧研究所提供，苜蓿品種、編號及拉丁名見表1。

1.2 試驗方法

挑選籽粒飽滿且均勻的5種苜蓿種子，用蒸餾水浸泡2 h，將其置于鋪有2層濾紙的發芽盒(12 cm ×12 cm)中，每盒50粒種子，加入20 mL不同濃度混合蘇打鹽堿溶液，以蒸餾水培養的種子作為對照，重復3次，將發芽盒置于HPG-280BX光照培養箱中，培養溫度為25℃，恒重法進行每天補水，以保持發芽盒內蘇打鹽堿濃度不變。

混合蘇打鹽堿濃度：以NaHCO3和Na2CO3兩種鹽堿9∶1混合，設置蘇打鹽堿濃度為10，20，30，40，50和55 mmol·L-1，相對應的pH分別為8.46，8.34，8.29，8.19，8.16和8.14。

種子萌發7 d后，將5種苜蓿的芽苗的地上部分和地下部分，取10株具代表性的芽苗，用游標卡尺分別測量它們的根長和芽長。將芽苗取出，挑選出10株具有代表性的芽苗，用吸水紙吸干芽苗上的水分后，立即稱重即為鮮重(Fresh weight，FW)，將上述以測量過鮮重(FW)的芽苗放入80℃烘箱，烘干至恒重，即為干重(Dry weight，DW)。

表1 5種苜蓿品種編號、審定年份及拉丁名Table 1 5 alfalfa variety number,approved year and Latin names

1.3 測定指標

種子萌發期間，每天計算種子的發芽數，各指標測定公式[8-10]如下：

種子發芽率(Germination rate，GR)=發芽種子數/種子總數×100%；

種子發芽勢(Germination potential，GP)=第三天發芽種子數/供試種子數×100%；

發芽指數(Germination index，GI) = ΣGt/Dt×100%(Dt為發芽日數，Gt為Dt相對應的每天發芽種子數與發芽日數)；

活力指數(Vigor index，VI)=發芽指數(GI)×胚根長(RL)；

胚芽長(Embryo length，EL)=(L1+L2+L3+……+L10)/10；

胚根長(Radicle length，RL)=(L1+L2+L3+……+L10)/10；

鮮重(FW)=(F1+F2+F3+……+F10)/10；

干重(DW)=(D1+D2+D3+……+D10)/10；

含水量(Water content，WC)=苜蓿鮮重(FW)-苜蓿干重(DW)。

1.4 耐鹽性評價及分析

耐鹽系數=(不同蘇打鹽堿濃度處理下平均測定值/對照組測定值)×100%

數據標準化：

隸屬度的計算[11]：對測得數據進行用模糊數學隸屬度公式進行轉換，隸屬函數公式為：

U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

公式中，U(Xijk)、U′(Xijk) 為第i個品種第j個脅迫濃度的k項指標的隸屬度，Xmin、Xmax分別為k項指標的最小值和最大值。

權重和綜合評價D值[12]的確定：

采用標準差系數法，用公式(2)計算標準差系數Vj，經公式(3)歸一化后得到各指標的權重系數Wj。

Vj=[Σ(Xij- (Xij)2]1/2/Xij

(2)

Wj=Vj/ΣVj

(3)

種質耐鹽綜合評價D值的計算公式為：D=∑(Xij×Wj)

1.5 數據處理

采用SPSS 21.0統計學軟件進行顯著性分析和主成分分析，用Excel 2007對數據進行計算。

2 結果與分析

2.1 蘇打鹽堿對苜蓿種子發芽率和發芽勢的影響

5種龍牧苜蓿種子隨混合蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，發芽率均呈下降的變化趨勢(表1)，濃度為55 mmol·L-1時，5種苜蓿種子的發芽率均為0，說明此濃度完全抑制了苜蓿種子的萌發。低濃度(10 mmol·L-1)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801和LM803種子的發芽率出現顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度下，LM806，LM807和LM808種子的發芽率高達50%以上，從發芽率的變化分析，LM806，LM807和LM808苜蓿對蘇打鹽堿的抗性高于LM801和LM803苜蓿。

5種龍牧苜蓿種子隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，發芽勢均呈下降的變化趨勢(表1)，低濃度(10 mmol·L-1)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801，LM803和LM806種子的發芽勢出現顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，LM807和LM808種子的發芽率高達60%以上，從發芽勢的變化分析，LM807和LM808苜蓿對蘇打鹽堿的抗性高于LM801，LM803 和LM806苜蓿。

表1 混合蘇打鹽堿脅迫下種子發芽率和發芽勢Table 1 Seed germination rate and germination potential under mixed soda saline-alkali stress

注：同列不同小寫字母表示脅迫濃度間在0.05水平差異顯著;“-”代表在脅迫處理下種子未萌發，下同

Note:Different lowercase letters in column show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“-”indicates no germinate of seed under stress treatment,the same as below

2.2 蘇打鹽堿對苜蓿種子發芽指數和活力指數的影響

5種龍牧種子隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，發芽指數均呈下降的變化趨勢(表2)，與對照比較低濃度(10 mmol·L-1)對LM803，LM807苜蓿種子發芽指數影響不大，對LM801，LM806 和LM808發芽指數的影響比較大，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801，LM803和LM806種子的發芽勢出現顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度下，LM807和LM808種子的發芽指數高達50%以上，從發芽指數的變化分析，LM807和LM808苜蓿對蘇打鹽堿的抗性高于LM801，LM803和LM806苜蓿。

除LM807苜蓿外，4種龍牧種子隨蘇打鹽堿濃度的增加，活力指數均呈下降的變化趨勢(表2)，與對照比較低濃度(10 mmol·L-1)對LM806，LM808苜蓿種子發芽指數影響比較大，對LM801，LM803 和LM808的活力指數影響不大，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，LM801，LM803和LM806種子的活力指數出現顯著的抑制作用，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，LM807和LM808種子的活力指數高達500以上，從活力指數的變化分析，LM807和LM808苜蓿對蘇打鹽堿的抗性高于LM801，LM803 和LM806苜蓿。

表2 混合蘇打鹽堿脅迫下種子發芽指數和活力指數Table 2 Seed germination index (GI) and vigor index (VI) under mixed soda-alkali stress

2.3 蘇打鹽堿對苜蓿種子芽苗生長的影響

除LM803苜蓿外，4種龍牧種子隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，芽苗的胚芽長均呈增加的變化趨勢(表3)，與對照比較低濃度(10 mmol·L-1)促進芽苗的生長，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，5種龍牧種子的胚芽長均受到不同程度的抑制；除LM803和LM808苜蓿外，LM801，LM806 和LM807 種子隨混合蘇打鹽堿濃度的增加，芽苗的胚根長均呈增加的變化趨勢(表3)，與對照比較低濃度(10 mmol·L-1)促進芽苗胚根的生長，在30 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，5種龍牧種子的胚根長均受到強烈的抑制生長，在40和50 mmol·L-1鹽堿濃度下完全抑制芽苗的生長，培養7 d時，胚芽停止生長甚至壞死，說明其芽苗期對蘇打鹽堿比較敏感。

表3 混合蘇打鹽堿脅迫下種子的胚芽長和胚根長Table 3 Embryo length (EL) and radical length (RL) under mixed soda-alkali stress

2.4 蘇打鹽堿對苜蓿種子的芽苗鮮重、干重和含水量的影響

由表4可知，LM801，LM806和LM807鮮重和干重均隨蘇打鹽堿濃度的增加而呈現先增加后降低的變化趨勢，說明蘇打鹽堿濃度為10 mmol·L-1時促進植株對水和無機鹽離子的運輸和吸收，而LM808的鮮重和干重隨鹽堿濃度的增加而呈現下降的變化趨勢，蘇打鹽堿濃度低于40 mmol·L-1時，僅LM807還存在一定的芽苗。

除LM808的芽苗含水量外，4種苜蓿芽苗的含水量均隨蘇打鹽堿濃度的增加而呈現先增加后下降的變化趨勢(表4)，由于品種間的差異和不同濃度的鹽堿脅迫形成的滲透勢不同，各品種含水量的變化幅度也不同。蘇打鹽堿濃度為10 mmol·L-1時，LM807表現出較強的吸水能力來維持自身生長發育所需要的水分，其余各品種吸水能力較差，自身生長受到明顯抑制。

表4 混合蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿芽苗鮮重、干重和含水量Table 4 Fresh weight,dry weight and water content of alfalfa buds and seedlings under mixed soda saline-alkali stress

2.5 對芽苗期各指標進行主成分分析

主成分的特征值和貢獻率是選擇主成分的重要依據，由表5知，在測定的9個發芽指標和芽苗生長指標中，前2個主成分反映了總信息量的90.172%，特征值總和達到8.115，表明這兩個主成分基本上能反映苜蓿抗蘇打鹽堿能力。

表5 各指標主成分分析的特征值和方差貢獻率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate of principal component analysis of each index

通過對9個指標主成分分析矩陣的計算，獲得了各指標貢獻大小的特征向量見表6，主成分分析共得到2個主成分，主成分1中VI，GR，GI，GP，RL具有較大正載荷值，DW和EL載荷值次之，而FW和WC具有負載荷值，表明主成分1主要反映了VI，GR，GI，GP，RL等指標，主成分2中FW，WC具有較大正載荷值，EL，DW，RL載荷值次之，即主成分2主要反映FW，WC等指標。

表6 各指標主成分分析矩陣和特征向量Table 6 Principal component analysis matrix and eigenvector of indicators

注：GR，GP，GI，VI，DW，FW，WC，EL和RL分別代表發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、干重、鮮重、胚芽長、胚根長

Note：GR，GP，GI，VI，DW，FW，WC，EL and RL respresent germination rate，germination potential，germination index，vigor index，dry weight，fresh weight，water content，embryo length and radicle length,respectively

2.6 對芽苗期各指標進行隸屬函數、權重系數及D值綜合分析

根據主成分分析結果，特征向量表示各單獨指標對總指標的貢獻大小，挑選主成分中特征向量大于0.16的各指標，主要有GR，GP，GI，VI，FW，WC，EL，采用隸屬函數和權重系數(Wj)對5苜蓿種子萌發期的7項指標進行綜合分析。結果如表7，各品種耐鹽性由強到弱依次為：LM807>LM808>LM806>LM803>LM801。

表7 各指標隸屬值、權重系數、綜合評價D值Table 7 The membership function value,weight coefficient and comprehensive evaluation D value of each index

3 討論

苜蓿種子在不同的鹽堿條件下萌發率高低是其能否在鹽堿環境中生存的基礎[13]。但一項指標無法全面無誤地反映品種耐鹽堿性萌發的強弱，所以選取發芽率等多項指標數據進行綜合分析，來分析在種子萌發期耐鹽的品種[14]。萌發率能直接的反應種子耐鹽堿脅迫的基礎，研究結果與古麗內爾·亞森等[15]人的研究成果一致，鹽生植物在低鹽度和蒸餾水中的種子萌發率沒有顯著的差異，但是隨著鹽度的增高，其萌發率下降。其中種子活力指數既能反映種子的發芽率，又能客觀反映種子的萌發質量[16]。種子這4項數據同時保持較高的值，才能證明種子能快速、整齊的萌發，并保持幼苗的粗壯。

從根長、芽長、鮮重、干重、含水量上分析，在低濃度脅迫下根的生長發育受到促進作用，使根系能夠保持相對高于對照組根系的活力，維持高水平的吸收、運輸等功能，增加根的吸水能力，營養物質的運輸，使快速的發育、伸長；高濃度的鹽堿脅迫下，苜蓿幼苗生長緩慢，有的開始衰亡、腐爛，這與王素平等[17]人的實驗結果相似，植物根系總吸收面積受到一定抑制、質膜透性升高并伴隨吸水能力下降，使葉片相對含水量下降，從而導致光合速率降低，鹽脅迫對植株的傷害加重[18-19]。

通過主成分分析可知，GR，GP，GI，VI，FW，WC，EL等指標可以較好得反映龍牧苜蓿品種的抗鹽性，利用隸屬函數法，賦予7個萌發指標以權重，通過矩陣運算和綜合排序可知，LM807的綜合D值最高，LM801的綜合D值最低，表明龍牧807苜蓿的耐鹽堿性最強，龍牧801苜蓿的耐鹽堿性最弱，研究結果與田小霞等[20]人對苜蓿屬植物苗期耐鹽指標篩選及耐鹽性綜合評價所得到的結果相似，利用D值對龍牧苜蓿種質資源的耐鹽性進行綜合評價，解決了植物耐鹽性評價方法中多個指標之間無法進行統一比較的問題，對龍牧苜蓿種質資源的耐鹽堿性予以準確、科學的評價。這與前人在番茄[21]、披堿草[22]、花椰菜[12]等植物耐鹽性評價中的發現類似，這種綜合評價體系的構建為耐鹽堿性優質牧草的選育提供一定依據。

4 結 論

5種龍牧苜蓿種子在混合蘇打鹽堿脅迫下，低濃度(10 mmol·L-1)對種子的發芽率、發芽勢、活力指數和發芽指數影響比較小，對芽苗的生長表現出一定的促進作用，而在蘇打鹽堿濃度超過30 mmol·L-1時，對種子的萌發和芽苗的生長產生了明顯的抑制作用。5種龍牧苜蓿種質資源的耐鹽堿性由高到低依次為：龍牧807苜蓿>龍牧808苜蓿>龍牧806苜蓿>龍牧803苜蓿>龍牧801苜蓿，為蘇打鹽堿地選擇適種苜蓿品種提供一定的科學依據。