生物有機肥對不同連作年限設施黃瓜土壤微生物數量和酶活性的影響

王燕云，趙龍杰，郝春莉，蔡盡忠，*

(1.廈門華廈學院 檢驗科學與技術系，福建 廈門 361024； 2.廈門市環境監測工程技術研究中心，福建 廈門 361024)

我國是世界上最大的設施蔬菜種植國家[1]。受生產栽培條件限制及經濟利益驅使，設施內蔬菜種植種類單一，連作現象普遍存在。黃瓜作為一種重要的瓜類蔬菜，其栽培面積約占設施栽培總面積的 60%。設施黃瓜連作導致土壤質量下降，黃瓜生長勢變弱、產量降低、品質下降、病蟲害嚴重。這已成為制約設施黃瓜可持續發展的瓶頸問題。設施黃瓜連作障礙的防控技術包括嫁接[2]、土壤消毒[3]、輪作[4]、生物有機肥[5]等。其中，嫁接技術和土壤消毒技術煩瑣且成本高，輪作并不適合各蔬菜基地單一品種的趨向。生物有機肥作為一種緩解連作障礙的措施，不僅成本較低，而且應用方便。

土壤微生物和土壤酶是土壤生態系統的重要組成成分，是評價土壤生態質量的重要指標。土壤微生物是土壤生化反應的推動者和參與者，是土壤有機無機復合體的重要組成部分，被認為是表征土壤質量變化最敏感、最有潛力的指標[6]。土壤酶活性在土壤養分循環中起著重要作用，體現了土壤總的生物學活性，表征了土壤的綜合肥力特征及土壤養分轉化進程，可以作為衡量生態系統土壤質量變化的預警和敏感指標[7]。

木霉菌是一種廣泛用于植物病害生物防治和改善作物生長的絲狀真菌，能夠增加作物產量和品質，還能改良土壤[8]。北蟲草為冬蟲夏草同屬藥用真菌，其人工栽培目前以小麥、大米、小米或高粱作為養分來源。規模化人工栽培北蟲草，子實體采收后剩下的培養基數量很大，且營養豐富，有很大的開發空間。古龍酸母液是維生素C(VC)二步發酵過程中產生的酸性廢棄液，含有豐富的低分子量有機酸，能夠改善土壤質量[9]。北蟲草廢棄培養基和古龍酸母液產量很大，目前尚無高效的處置方法，將其排放于環境中既造成環境污染又浪費資源。

本研究利用木霉菌、北蟲草廢棄培養基、古龍酸母液通過堆肥制備了一種生物有機肥，經過前期試驗，發現其對設施土壤具有顯著的改良效果。將此生物有機肥施用于不同連作年限的設施黃瓜土壤，通過測定土壤微生物數量、酶活性、黃瓜產量和黃瓜品質指標，揭示生物有機肥對連作黃瓜土壤生態質量和產量的影響，為指導平衡施肥與土壤養分管理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

深綠木霉菌由中科院微生物研究所菌種庫提供。北蟲草廢棄培養基取自河南省濮陽市北蟲草培養基地。古龍酸母液取自石藥集團。生物有機肥由深綠木霉菌、廢棄培養基、古龍酸母液按菌料比(質量比)1∶250∶250添加，調節含水量至50%，pH調至6.5，攪拌均勻后，堆成高約1 m的金字塔形，堆肥開始每5 d翻堆一次，堆肥30 d時，堆肥腐熟。該生物有機肥呈褐色粒狀，無惡臭，有機質含量為49.88%，總N含量為2.80%，P2O5含量為2.28%，K2O含量為0.58%，水分含量為18.56%，pH值6.62，總As含量為3.15 mg·kg-1，總Hg含量為0.77 mg·kg-1，總Pb含量為18.14 mg·kg-1，總Cd含量為0.45 mg·kg-1，總Cr含量為33.47 mg·kg-1。這些指標皆符合我國農業行業有機肥料標準(NY 525—2012)。

1.2 盆栽試驗

2017年5月以盆栽方式進行生物有機肥的施肥試驗。試驗土壤取自山東省壽光市孫家集鎮大棚連片區0—20 cm根區耕層，包括4種土壤：未連作土壤(設施周邊玉米-辣椒輪作土壤)，以及連作3、7、11 a的設施黃瓜土壤(同一蔬菜和同一管理水平)，4種土壤的養分含量如表1所示。生物有機肥的施用量包括4個水平：未施肥、低用量(7.5 t·hm-2)、中等用量(15 t·hm-2)、高用量(30 t·hm-2)。試驗共設置16個處理，每個處理6個重復。盆栽時，每盆中放入1.5 kg土壤，均勻撒入大小一致的5粒黃瓜種子，當黃瓜幼苗株高為10 cm時，每盆間苗至3株，至黃瓜株高達50 cm時，每盆最終留苗1株。在黃瓜培養期間保持各盆土壤水分含量為田間持水量的60%。記錄每盆的黃瓜產量，盛果期每個處理取6個代表植株的代表性果實測定黃瓜品質指標(VC、可溶性蛋白質、可溶性糖含量)，同時分別采集盆中土壤，過2 mm篩，測定土壤微生物數量和酶活性。

表1供試土壤養分特征

Table1Nutrients property of test soils

連作年限Continuouscropping year/a有機質Organic matter/(g·kg-1)總氮Total N/(g·kg-1)總磷Total P/(g·kg-1)總鉀Total K/(g·kg-1)速效氮Available N/(mg·kg-1)速效磷Available P/(mg·kg-1)速效鉀Available K/(mg·kg-1)023.650.810.721.1327.5824.3129.09325.180.890.811.1931.3445.1852.47732.761.121.051.3254.7938.7641.551142.151.461.381.5748.2732.3434.02

1.3 測試方法

VC含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定，可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[10]。土壤微生物數量采用平板計數法[11]：細菌計數采用牛肉膏蛋白胨培養基，真菌計數采用馬丁氏培養基，放線菌計數采用改良高氏一號培養基，木霉菌計數采用木霉菌選擇性培養基(TSM)，尖孢鐮刀菌計數采用尖孢鐮刀菌分離培養基(PEA)[12]。土壤蔗糖酶活性采用二硝基水楊酸比色法測定[13]，磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸鹽法測定[11]，過氧化氫酶活性采用滴定法測定[14]，脲酶活性采用次氯酸鈉比色法測定[15]。

1.4 數據分析

為了總體評價生物有機肥對連作設施土壤質量的修復效果，消除土壤微生物數量和酶活性量綱不同對土壤質量總體評價的影響，參考王兵等[16]和楊長明等[17]評價土壤綜合質量的方法，采用隸屬度評價土壤質量。

所有土壤指標數據均在土壤烘干(105 ℃)質量的基礎上進行計算。所有的試驗數據應用SPSS 17.0軟件進行方差分析，用Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2.1 對連作黃瓜產量和品質的影響

如圖1所示，從連作年限的角度分析，在不施生物有機肥的條件下，當連作年限從0增長到3 a時，黃瓜產量和黃瓜可溶性糖含量無顯著差異，黃瓜VC含量卻呈現顯著(P<0.05)差異；當連作年限從3 a延長到7 a或11 a時，黃瓜產量及黃瓜可溶性糖含量顯著(P<0.05)下降，但與未連作的處理相比并無顯著差異，連作11 a處理的黃瓜VC含量顯著(P<0.05)低于連作3 a處理的黃瓜，但與連作7 a處理的黃瓜并無顯著差異。在施用低量生物有機肥的條件下，當連作年限從0增長到3 a時，黃瓜VC含量無顯著差異；當連作年限從3 a延長到7 a或11 a時，黃瓜VC含量顯著(P<0.05)下降。在施用中、高量生物有機肥的條件下，不同連作年限處理的黃瓜產量，以及黃瓜VC、可溶性糖含量均無顯著差異。在施肥量相同的條件下，不同連作年限下黃瓜可溶性蛋白質含量始終無顯著差異?？梢钥闯?，黃瓜產量和品質總體在連作3 a處理下尚無明顯負面影響，但隨著連作年限的繼續延長開始降低，表明設施黃瓜存在著嚴重的連作障礙問題。

從生物有機肥施用量的角度分析，相同連作年限下，黃瓜產量和品質指標均隨著施肥量的增加而增加，高用量下的黃瓜產量，以及VC、可溶性糖含量均顯著(P<0.05)高于不施用生物有機肥的處理。相同連作年限下，不同生物有機肥用量處理的黃瓜可溶性蛋白質含量同樣無顯著差異。可以看出，高用量生物有機肥可明顯提高長期連作黃瓜的產量和品質。

2.2 對連作土壤微生物數量的影響

如圖2所示，從連作年限的角度分析，隨著設施黃瓜連作年限的增加，土壤細菌、放線菌、木霉菌數量總體呈現先增加后逐漸降低的趨勢，在連作3 a時達到峰值；土壤真菌數量總體持續緩慢增加；土壤尖孢鐮刀菌數量在連作3 a以前緩慢增長，之后總體呈現急劇增長的趨勢。以上結果表明，在連作3 a以內，土壤的生態質量尚無明顯劣化，當連作年限進一步延長，隨著病原真菌——尖孢鐮刀菌數量的急劇增長，土壤生態環境急劇惡化。

柱上無相同小寫字母的表示同一連作年限不同施肥量處理間存在顯著差異(P<0.05)，無相同大寫字母的表示同一施肥量不同連作年限處理間存在顯著差異(P<0.05)。Bars marked without the same lowercase letters indicated significant difference at P<0.05 among the treatments with the same continuous cropping years yet different application rate of bio-organic fertilizer. Meanwhile， bars marked without the same uppercase letters indicated significant difference at P<0.05 among the treatments with different continuous cropping years yet the same application rate of bio-organic fertilizer.圖1 不同處理對連作土壤黃瓜產量和品質的影響Fig.1 Effect of different treatments on cucumber yield and quality

從生物有機肥對連作土壤修復效果的角度分析，不同連作年限的土壤細菌、放線菌、木霉菌數量均隨著施肥量的增加而增加，而尖孢鐮刀菌的數量則隨著施肥量的增加而下降，連作年限越長，減少的幅度越大，高用量下連作3、7、11 a的土壤尖孢鐮刀菌數量分別比未施肥處理減少了75.13%、94.72%、97.37%。以上結果說明，生物有機肥能夠有效抑制連作土壤中病害真菌的數量，改善土壤的微生態平衡，對長期連作土壤具有明顯的改善效果。

2.3 對連作土壤酶活性的影響

土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶分別與碳循環、有機質轉化、氮循環和磷循環相關，可以表示土壤的肥力質量。如圖3所示，從連作年限的角度分析，隨著設施黃瓜連作年限的增加，土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性總體呈現先提高后降低的趨勢，在連作3 a時達到峰值，而后蔗糖酶和過氧化氫酶活性緩慢降低，脲酶和磷酸酶活性較大幅度地降低。從生物有機肥對連作土壤修復效果的角度分析，不同連作年限的土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性均隨施肥量的增加而提高，且高用量生物有機肥對連作年限長的土壤酶活性的作用效果更明顯。

2.4 不同處理下連作土壤質量評價

如圖4所示，隨著設施黃瓜連作年限的延長，土壤質量隸屬度總體呈現了先升高后降低的趨勢，在連作3 a時達到峰值，但連作年限越久，土壤質量越差。從生物有機肥對連作土壤修復效果的角度分析，不同連作年限的土壤隸屬度均隨施肥量的增加而提高，且生物有機肥對連作年限長的土壤質量的修復效果更好。

3 討論

本研究表明，設施黃瓜土壤質量隨著連作年限的延長呈現先升高后降低的趨勢，連作3 a時最高，而連作11 a時最低，表現出了明顯的連作障礙問題。土壤連作障礙發生的因素包括自毒物質和致病真菌的積累[18]。由于3 a的連作時間較短，土壤中還未積累過多的自毒物質和致病菌，加上人工管理對土壤質量的提升作用，因而連作3 a時土壤的質量最高，表現出高的黃瓜產量和品質。土壤細菌、放線菌和真菌的區系組成和數量變化常能反映出土壤生物活性水平[19]。在未施生物有機肥的處理中，隨著連作年限的進一步延長，土壤細菌與真菌數量的比例不斷減少，由未連作土壤的5 756∶1減少為連作11 a時的1 230∶1，土壤肥力由“細菌型”向“真菌型”轉變，土壤中自毒物質和致病真菌不斷積累，其中尖孢鐮刀菌數量在連作7 a和11 a時分別比未連作土壤大幅提高了8.61倍和21.61倍，引發了嚴重的連作障礙問題，因而土壤生態質量和黃瓜產量品質都顯著降低。馬云華等[20]、賀麗娜等[21]、劉來等[22]研究了連作對溫室黃瓜和大棚辣椒土壤性質的影響，結果均表明，土壤細菌和放線菌數量、土壤酶活性隨連作年限延長先升高后降低，在連作5 a后開始降低，真菌數量和病原真菌數量一直增加，這與本研究的結果一致。

圖2 不同處理對連作土壤微生物數量的影響Fig.2 Effect of different treatments on microbe number of continuous cropping soil

圖3 不同處理對連作土壤酶活性的影響Fig.3 Effect of different treatments on enzymes activities of continuous cropping soil

圖4 不同處理對連作土壤質量隸屬度的影響Fig.4 Effect of different treatments on quality membership of continuous cropping soil

向連作土壤施入生物有機肥后，尤其是在高用量下，土壤質量能夠恢復到或者超越未連作土壤水平。本研究施用的生物有機肥由木霉菌、北蟲草廢棄培養基和古龍酸母液混制堆肥而成。木霉菌是一種拮抗真菌，在識別病原真菌過程中能夠分泌一系列細胞壁降解酶和次生代謝物，形成侵入結構，最終抑制病原真菌的增殖[8]?？赡苷堑靡嬗诖?，本研究中施入高量生物有機肥處理的土壤病原真菌——尖孢鐮刀菌的數量大幅度減少。同時，放線菌數量也隨著生物有機肥施用量的增加而不斷提高，高用量下連作土壤的放線菌數量高于未連作土壤，而放線菌大多能產生抗生素[23]，拮抗病原真菌。在上述因素的綜合作用下，本試驗施用的生物有機肥有效抑制了連作土壤中尖孢鐮刀菌等病害真菌的發生。肥料中廢棄北蟲草培養基的主要成分為小麥粒，可為土壤微生物提供充足的有機物質。組成肥料的古龍酸母液含有豐富的低分子量有機酸，低分子量有機酸能夠透過細菌較薄的細胞壁和細胞膜，作為能源物質被細菌利用[24]。這些因素都有利于促進土壤細菌的增殖。在連作11 a的土壤中，土壤細菌真菌比例由未施肥時的1 230∶1增加到高用量生物有機肥的1 473∶1，土壤肥力由“真菌型”向“細菌型”轉變，土壤生態環境趨好。

土壤酶活性與土壤功能緊密相關，土壤生態系統改良通常都伴隨著土壤酶活性的提高[25]。蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性分別與土壤碳、氮、磷循環密切相關，可以表征土壤中碳、氮、磷的轉化能力，過氧化氫酶活性與有機質轉化相關[26]，其活性被視作反映土壤肥力的指標[27]。生物有機肥中含有大量的有機質和氮、磷等養分，施入到連作土壤后作為酶的底物激發了相應土壤酶的活性。這也就意味著生物有機肥能夠加速土壤養分元素的周轉，提高土壤肥力。本研究中生物有機肥提高了連作土壤的微生物數量和酶活性，尤其是高用量生物有機肥使連作7 a和11 a土壤的微生物數量和土壤酶活性恢復到或超越未連作土壤水平，表明本試驗所采用的生物有機肥能夠有效改良連作土壤的生態質量，使其恢復到正常水平。一些學者將生物有機肥用于連作黃瓜[5]、連作番茄和辣椒[28]、馬鈴薯[29]、連作切花菊[30]土壤后，發現生物有機肥顯著提高了連作土壤細菌、放線菌數量和土壤酶活性，降低了土壤真菌和病原真菌數量，這與本研究的結果基本一致。

生物有機肥施入設施黃瓜連作土壤后，土壤連作年限越長，生物有機肥修復土壤的效果越顯著。這是因為該生物有機肥中的木霉菌是病原微生物的拮抗菌，對于連作年限短的土壤，病原菌含量很少，土壤質量較高，因而生物有機肥中只有廢棄北蟲草培養基和古龍酸母液可起到部分促進細菌增殖和提高土壤酶活性的作用。隨著連作年限延長，土壤中的病原微生物急劇增多，生態質量變差，此時生物有機肥中的木霉菌能夠充分發揮其抑制病原菌增殖的功能，同時與生物有機肥中的另外2種成分協同作用，因而展現出更明顯的修復效果。