針刺對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠血清IL-4和TNF-α的影響

劉金星,胡 瓊,丁 寧,袁 斕

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院,四川 成都610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 發(fā)展規(guī)劃處,四川 成都610075)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)作為醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的一種復(fù)雜的自身免疫性疾病,雖然病因尚不明確,但輔助T細(xì)胞免疫平衡功能異常在RA的發(fā)病中起到的中心環(huán)節(jié)作用已得到普遍認(rèn)同。T 細(xì)胞主要是通過細(xì)胞相互作用以及分泌的細(xì)胞因子在RA致病中扮演不同的角色[1]。Th1/Th2失衡導(dǎo)致的Th1或Th2占主導(dǎo)的免疫漂移是引起RA的重要免疫學(xué)機制,免疫性炎癥反應(yīng)是其主要表現(xiàn)[2]。因此恢復(fù)Th1/Th2的平衡對于治療RA有積極作用。

Th1細(xì)胞分泌的促炎TNF-α因子和Th2細(xì)胞分泌的抗炎IL-4因子的含量變化是Th1/Th2比例變化的表現(xiàn)之一[3]。基于此,本實驗從分子水平出發(fā),通過檢測針刺后RA小鼠血清中IL-4和TNF-α的含量,觀察其RA小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的影響,探討針刺治療RA細(xì)胞因子層面的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 動物

取24只雄性小鼠,體重18～22 g。實驗動物由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供(實驗動物許可證號：SCXK(川)2015-030)。小鼠在進(jìn)行1周的適應(yīng)性馴養(yǎng)后開始實驗,每4只一籠群養(yǎng),飼養(yǎng)于普通動物實驗室,室溫控制在23～25℃,定時通風(fēng)換氣,自然明暗周期,自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要試藥與儀器

1.2.1 試劑 MouseIL-4ELISAKIT(規(guī)格：96孔/盒,貨號：xl-Em0194)；MouseTNF-aELISAKIT(規(guī)格：96孔/盒,貨號：xl-Em0359)。以上均由abcam生產(chǎn),鑫樂生物進(jìn)口分裝。

1.2.2 儀器 華佗牌一次性針灸針(常規(guī)0.25 mm×13 mm),粗細(xì)為32號,長短為0.5寸。計算機(TFT185W80PS,冠捷顯示科技有限公司)；酶標(biāo)儀(MultlskanMk3,賽默飛世爾儀器有限公司)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(UPH-Ⅱ-10T,成都超純科技有限公司)；電子恒溫水浴鍋(DZKW-4,北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(SYQ-DSX-280B,上海申安醫(yī)療器械廠)；移液槍(規(guī)格1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL,大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)；槍頭(規(guī)格1000μL、200μL、20 μL,美國Axygen公司)；EP管(規(guī)格1.5 m L、0.2 m L、100 μL,美國Axygen公司)。

2 方法

2.1 分組

采用完全隨機的方法將小鼠分為3組,每組8只,分別為空白對照組(簡稱空白組)、RA模型組(簡稱模型組)、針刺治療組(簡稱針刺組)。在開始治療后的第21天處死各組小鼠(頸椎脫臼法),提取眼部血液進(jìn)行相關(guān)檢測。

2.2 造模方式

在實驗開始的第1天,參照文獻(xiàn)[4-6],將II型膠原與0.1 mol/L乙酸溶液配制成2 mg/m L的溶液,在4℃的環(huán)境中充分?jǐn)嚢璨Υ?第2天按照1∶1的比例將其與弗氏完全佐劑進(jìn)行混合乳化處理,使之完全乳化。除空白組外,每只小鼠皮下注射共200μL乳液,注射部位為背部的4～6點。1周后將等量不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原乙酸溶液混合并使之乳化,通過皮下注射方式,將100μL液體注射于每只小鼠尾根部3～5點。1周后將等量不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原乙酸溶液混合并使之乳化,將100μL液體皮下注射于小鼠左右后足趾,左右各50μL。一般在末次免疫后的7～12天,80%以上造模小鼠會表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎相關(guān)癥狀。參照5級評分法觀察記錄關(guān)節(jié)炎指數(shù),觀測記錄時間為免疫前和免疫后的第3、5、7、12天。采用足趾容積測量儀測量踝關(guān)節(jié)的容積,觀察關(guān)節(jié)腫脹度,每周測定2次,每次反復(fù)測定3次取平均值[7]。

2.3 治療方法

于RA造模21天后開始針刺治療,用自制鼠架對針刺組小鼠進(jìn)行固定,選取腎俞和足三里穴進(jìn)行針刺,兩穴皆取雙側(cè),每日1次,治療時間均在下午15∶00-18∶00之間,每次30min。連續(xù)治療6天為1個療程,整個實驗共3個療程,每2個療程間隔1天。參照文獻(xiàn)[8](《實驗針灸學(xué)》的動物穴位圖譜)進(jìn)行定位。用同樣的方法對空白組和模型組小鼠進(jìn)行固定,但不實施針刺治療。實驗過程中針刺組因操作不當(dāng),1只在治療前死亡,其余7只小鼠正常治療。其余組小鼠未有異常。

2.4 觀察指標(biāo)和檢查方法

取各組小鼠外周血,分離其上清液。采用ELISA聯(lián)合檢測代表Th1和Th2型細(xì)胞因子的(TNF-α、IL-4)的分泌水平,分析Th1和Th2細(xì)胞的分化格局。步驟為①復(fù)溫：將所有試劑平衡至室溫；②標(biāo)準(zhǔn)品稀釋；③加樣；④配液；⑤洗滌；⑥顯色；⑦終止：每個孔加終止液50μL；⑧測定：將空白調(diào)整為零,于450nm波長下依次檢測各個孔的吸光度(OD值)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后,組間比較用單因素方差分析。方差齊時,選用LSD(LeastSignificantDifference,最小顯著差異法),方差不齊,選用Tamhane'sT2檢驗。P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 針刺對實驗性RA小鼠血清中IL-4含量的影響

表1結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠血清中IL-4含量降低,差異極顯著(P＜0.01)。與模型組相比,針刺組小鼠血清中IL-4含量升高,差異顯著(P＜0.05)。提示針刺治療能明顯提高實驗性RA小鼠血清中IL-4含量。

表1 針刺對實驗性RA小鼠血清組織中IL-4含量的影響(±s)

表1 針刺對實驗性RA小鼠血清組織中IL-4含量的影響(±s)

注:與空白組比較,#P＜0.05,## P＜0.01,與模型組比較,*P＜0.05,**P 0.01。

組別 樣本數(shù)量(n) 含量(ng/L)空白組 8 11.66±1.88模型組 8 8.54±1.37##針刺組 7 10.69±1.04*

3.2 針刺對實驗性RA小鼠血清中TNF-α含量的影響

表2結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠血清中TNF-α含量升高,差異極顯著(P＜0.01)；與模型組相比,針刺組小鼠血清中TNF-α含量降低,差異顯著(P＜0.05)。提示針刺治療能明顯降低實驗性RA小鼠血清中TNF-α含量。

表2 針刺對實驗性RA小鼠血清組織中TNF-α含量的影響(±s)

表2 針刺對實驗性RA小鼠血清組織中TNF-α含量的影響(±s)

注:與空白組比較,#P＜0.05,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

組別 樣本數(shù)量(n) 含量(ng/L)空白組 8 42.87±7.50模型組 8 59.88±14.93##針刺組 7 46.73±10.68*

4 討論

RA的主要病理表現(xiàn)包括滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、血管新生等,繼而導(dǎo)致軟骨與骨膜破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,功能喪失。其病因病機較為復(fù)雜,至今仍未能完全明確。目前許多研究表明,細(xì)胞因子與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),關(guān)系著疾病的治療及預(yù)后。這些細(xì)胞因子能通過相互間的網(wǎng)絡(luò)參與細(xì)胞間的信息傳遞,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分化,促使炎癥反應(yīng)擴大[9]。

在RA細(xì)胞因子體系中,TNF-α處于上游,在其體系中有“中心犯罪”的作用[10]。TNF-α能影響免疫細(xì)胞反應(yīng)和非免疫炎性反應(yīng),促使相關(guān)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,介導(dǎo)疾病的發(fā)展。有研究表明,TNF-α可促使相關(guān)細(xì)胞分泌生長因子,造成血管翳,如滑膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞；還可導(dǎo)致糖蛋白合成減少,破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì),使得相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-8等炎性細(xì)胞因子,加強白細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔的聚集能力,進(jìn)一步導(dǎo)致組織損傷[11]。

Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-4,IL-4可促使IL-1和TNF-α細(xì)胞因子分泌水平降低,起到抑制后兩者腐蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨的作用。IL-4的分泌還能起到抑制IL-8和IL-6釋放的作用。在體外培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞中,IL-4對NK細(xì)胞有負(fù)調(diào)節(jié)的作用,既能減少IL-1分泌,又可以促進(jìn)表達(dá)IL-1受體拮抗物。IL-4不僅有利于Th2的增殖,還可抑制Th1細(xì)胞增生和拮抗TNF-α的前炎癥效應(yīng)[12]。因此,作為Th2細(xì)胞分泌的抗炎細(xì)胞因子,其可以減緩RA的發(fā)展。

大量臨床與實驗研究表明,免疫分子與免疫細(xì)胞的失衡可以通過針刺進(jìn)行調(diào)節(jié),針刺對免疫器官能起到保護(hù)作用并抑制免疫應(yīng)答[13]。足三里、腎俞二穴是臨床治療RA應(yīng)用頻次最多的兩個穴位,臨床療效顯著[14]。此次實驗運用的動物模型是T細(xì)胞和相關(guān)炎性因子引起的細(xì)胞免疫模型,與人類的發(fā)病機制有很高的相似度。此外,該模型具有急性和慢性RA的病理變化特點,是國際公認(rèn)的最好的RA動物模型[15-16]。

本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠血清中IL-4含量降低、TNF-α含量升高,差異極顯著(P＜0.01)。說明造模后小鼠血清中存在細(xì)胞因子的失衡,與以往研究相一致。而與模型組相比,針刺組小鼠血清中IL-4含量升高、TNF-α含量降低,差異顯著(P＜0.05)。說明針刺可以通過調(diào)節(jié)RA小鼠體內(nèi)IL-1和TNF-α的含量,改善Th1/Th2的失衡,起到免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用,有利于RA的治療與預(yù)后。