PMP衍生測(cè)定低聚木糖含量

高 暢,姜文月,廉淑梅,鄒 慧*,周立梅,楊 磊,張金秋,劉念遠(yuǎn)

(1.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司,吉林 長(zhǎng)春130000；2.吉林修養(yǎng)堂健康產(chǎn)業(yè)有限公司,吉林 撫松134500)

低聚木糖又稱木寡糖,是由2～7個(gè)木糖殘基以β-1,4糖苷鍵結(jié)合而構(gòu)成的低聚糖,其組成又以木二糖和木七糖為主[1]。低聚木糖作為一種新興的功能性食品配料,因具有優(yōu)良的加工特性和多種生理調(diào)節(jié)功能,被廣泛應(yīng)用于各種功能性食品[2]。低聚木糖能選擇性促進(jìn)腸道雙歧桿菌等有益菌增殖,使其成為腸道優(yōu)勢(shì)菌群,調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,因此,低聚木糖也被稱為超強(qiáng)雙歧因子[3]。此外,低聚木糖作為一種益鈣因子,可促進(jìn)鈣的吸收[4]。

由于低聚木糖在紫外區(qū)無(wú)吸收,直接采用紫外法或HPLC法無(wú)法測(cè)定。目前對(duì)木糖等單糖類成分進(jìn)行含量測(cè)定多采用示差折光檢測(cè)器,但示差檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度低,且不能梯度洗脫[5]。本研究先將低聚木糖水解成木糖,并與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生化后再采用HPLC-UV法測(cè)定青青膠囊中低聚木糖的含量,旨在為功能性產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供一種有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用樣品(青青膠囊)由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司提供；正己烷(色譜純)(德國(guó)Meker公司)；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。D-木糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；D-甘露糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)；甲醇(北京化工廠)；水均為純凈水。戴安Ultimate 3000高效液相色譜儀(Thermo四元泵,紫外檢測(cè)器)；離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；水浴鍋(金壇市江南儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液配制 取D-甘露糖適量,精密稱定,加水制成每lm L含2.5 mgD-甘露糖的溶液,作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液配制 取D-木糖2.5 mg于25 m L容量瓶中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 m L,加水適量使溶解并稀釋至刻度,搖勻。

1.2.3 樣品處理 稱取樣品25mg,精密稱定,加入25m L 80%乙醇超聲提取5min,離心分離上清液,重復(fù)超聲提取2次,合并上清液,低于50℃揮干,殘?jiān)铀芙?加入2 m L內(nèi)標(biāo)溶液,以水定容至25 m L,取1 m L溶液加0.5 m L 3 mo L/L鹽酸,水解1 h后,冷卻至室溫,加入0.5 m L 3 mo L/L氫氧化鈉,混合均勻后備用。

1.2.4 衍生 吸取樣品與對(duì)照品溶液各400μL,加0.5 mol/LPMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液與0.3 mol/L氫氧化鈉溶液各400μL,混勻,70℃水浴反應(yīng)100 min。加0.3 mol/L鹽酸溶液500μL,混勻,用三氯甲烷洗滌5次,每次2 m L,棄去三氯甲烷液,水層離心后,取上清液,過(guò)0.45μm濾膜,注入液相色譜儀,測(cè)定,計(jì)算。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：ACE C18(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L的乙酸銨溶液(17∶83)；柱溫：30℃；波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0m L/min；進(jìn)樣量：5μL。

1.3 計(jì)算

式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；AR為對(duì)照品的峰面積；cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；cR為對(duì)照品的濃度。

式中X為樣品中低聚木糖(以木糖計(jì))的含量,單位為g/100g；Ax為供試品的峰面積；As’為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；cs’為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度,單位為mg·m L-1；f為內(nèi)標(biāo)法校正因子；V為稀釋倍數(shù)；m1為總木糖稱樣量,單位為mg；m2為游離木糖稱樣量,單位為mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)選擇

分別考察D-鹽酸氨基葡萄糖、D-阿拉伯糖和D-甘露糖三種對(duì)照品作為內(nèi)標(biāo)的可能性,結(jié)果顯示：D-鹽酸氨基葡萄糖峰型拖尾,D-阿拉伯糖的峰與木糖的峰不能達(dá)到有效分離,D-甘露糖峰型較好,且與木糖可達(dá)到有效分離,確定內(nèi)標(biāo)為D-甘露糖。具體如圖1所示。

2.2 含量測(cè)定色譜圖

按照上述處理方法進(jìn)行樣品含量測(cè)定,色譜如圖2所示。

圖1 內(nèi)標(biāo)選擇色譜

2.3 線性關(guān)系考察

配制內(nèi)標(biāo)濃度為0.5 mg·m L-1,配制對(duì)照品濃度為1 mg·m L-1,分別吸取0.1 m L、0.25 m L、0.5 m L、0.75 m L、1 m L,每個(gè)濃度對(duì)照品均加入1 m L內(nèi)標(biāo),定容至5 m L,標(biāo)曲的濃度分別為 0.02 mg·m L-1、0.05 mg·m L-1、0.1 mg·m L-1、0.15 mg·m L-1、0.2 mg·m L-1,內(nèi)標(biāo)的濃度為0.1 mg·m L-1,以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo),對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=1.1281x+0.0123,R2=0.999 6,表明線性關(guān)系良好。 見圖3。

圖2 含量測(cè)定色譜

圖3 D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取6個(gè)樣品,平行處理,進(jìn)樣分析,結(jié)果表明：低聚木糖平均含量為23.31g/100 g,RSD=1.56%,證明此方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

分別稱取6個(gè)樣品,平行處理,衍生時(shí)取1/2樣品加1/2相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行衍生,結(jié)果：回收率均在99%～102%之間,RSD=0.47%,證明此方法的回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.6 耐用性試驗(yàn)

分別考察不同流速(0.8 mg·m L-1、1.0 mg·m L-1、1.2 mg·m L-1)、不同柱溫(25℃、30℃、35℃)、不同色譜柱條件下樣品的含量變化。結(jié)果：RSD分別為0.79%、0.17%、0.57%,表明此方法耐用性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察樣品在24h內(nèi)的穩(wěn)定性,同一樣品間隔3 h進(jìn)一次樣,結(jié)果：RSD為2.07%,表明此方法在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 三批中試樣品測(cè)定

取3批供試樣品,按照上述方法進(jìn)行測(cè)定,試驗(yàn)結(jié)果見表2。3批樣品中低聚木糖含量平均值為23.41g/100g。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

目前測(cè)定低聚木糖含量基本上是采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法[6],該方法的優(yōu)點(diǎn)是樣品處理簡(jiǎn)單、操作方便,不足是檢測(cè)靈敏度低、分離度差,且需要示差檢測(cè)器及氨基柱方可完成,對(duì)儀器及設(shè)備要求較高。本文完成前,還未發(fā)現(xiàn)使用本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定低聚木糖含量的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

柱前衍生化HPLC法是目前檢測(cè)多糖中單糖組成的常用方法,PMP作為還原性糖衍生化試劑之一,堿性條件下與單糖定量縮合生成單糖-PMP衍生物[7],因低聚木糖在紫外區(qū)無(wú)吸收,直接采用紫外法或HPLC無(wú)法測(cè)定,本文將低聚木糖水解成木糖,木糖與PMP中比喹啉酮基作用生成PMP-木糖衍生物,衍生物中含有苯基結(jié)構(gòu),在250 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)紫外吸收。經(jīng)過(guò)線性、重復(fù)性、回收率、耐用性、穩(wěn)定性等方法學(xué)考察,證實(shí)該方法科學(xué)可行。

研究結(jié)果顯示,建立的HPLC-UV法測(cè)定低聚木糖含量靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分離度好,可適用于保健食品中低聚木糖的質(zhì)量控制。