不同產地白及野生品與栽培品質量比較研究

周海婷,陳志敏,4,趙永峰,權 亮,張 希,李文兵,胡昌江,2*

(1.成都中醫藥大學,四川 成都611137；2.國家中醫藥管理局“中藥配方顆粒質量與療效評價”重點研究室,四川 成都611900；3.四川新綠色藥業科技發展有限公司,四川 成都611900；4.成都市中草藥研究所,四川 成都610016)

白及始載于《神農本草經》[1],為蘭科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖,具有收斂止血、消腫生肌的功效,臨床上用于治療結腸炎[2]、抑制變性鏈球菌、防齲齒[3]。白及不僅藥用價值高,而且極具觀賞價值,是我國現代醫藥工業和化妝品工業的重要原材料[4]。近年來白及的用藥需求急劇增加,但白及種子非常細小且無胚乳,因此在自然條件下主要靠一分為二的分株繁殖,形成規模需要10年甚至更長時間[5]。近年來,由于生態環境的破壞和市場需求的加大,白及價格從2006年開始出現快速增長,2009年下半年至2012出現暴漲,如2012年人工種植白及的市場價達到每公斤140元左右,而野生白及的價格則高達每公斤1 200元。因此,人工栽培白及以替代野生白及已經成為必然趨勢。

目前,學術界對于人工栽培白及的品質缺乏系統性研究,不同程度上影響了人工栽培白及的推廣應用。因此,本研究從性狀、鑒別、水分、灰分、多糖含量、浸出物含量和1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)含量及5種微量元素等方面,對野生與栽培白及進行質量分析,比較二者差異,為栽培白及的推廣應用提供參考。

1 材料與試劑

1.1 材料收集

本研究總共收集了8個省20批供試品白及樣品；其中野生10批,栽培10批,均經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定為蘭科白及屬植物白及Bletilla Striata(Thunb)Reichb.f.的干燥塊根莖。將樣品粉碎,過5號篩備用。樣品詳情見表1。

1.2 儀器與試劑

島津LC-2030高效液相色譜儀(日本島津公司)；BP211D電子天平(感量0.01 mg)；BS200S電子天平(感量0.001g),德國Sartorius公司；超聲波清洗器KQ-600DB(昆山市超聲儀器有限公司)；箱式電阻爐；電熱恒溫鼓風干燥箱；半自動點樣儀；紫外可見分光光度計；高通量消解儀；電感耦合等離子體質譜儀。

1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)對照品(批號17110623,上海同田生物技術有限公司提供)。乙腈為色譜純；怡寶純凈水；優級純硝酸；銅、砷、鎘、汞、鉛標準儲備液均購自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院(規格50m L,1 000μg/m L)；其他試劑均為分析純。

表1 白及樣品信息

2 方法與結果

2.1 性狀測定

通過直接觀察法觀察白及的顏色,并用游標卡尺測量白及的長寬。結果見表2和圖1。

表2 野生白及與栽培白及性狀對比

圖1 野生白及與栽培白及

2.2 薄層鑒別

按2015年版《中國藥典·白及》相關薄層鑒別方法進行測定。見圖2和圖3。

圖2 野生白及樣品薄層圖譜

圖3 栽培白及樣品薄層圖譜

2.3 水分、灰分測定

精密稱取白及粉末2g,按《中國藥典》2015年版第4部(附錄0832)“水分測定法”中的“烘干法”進行測定。

精密稱取白及粉末2g,按《中國藥典》2015年版第4部(附錄2302)“灰分測定法”進行測定。

2.4 浸出物含量測定

取供試品2g,精密稱定,置250m L錐形瓶中,加稀乙醇50 m L,密篩,稱定重量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持1 h,放冷后,取下錐形瓶,密篩,再次稱定重量,用稀乙醇補足減失的重量,搖勻,用干燥濾器濾過,精密量取25 m L,置已經干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴蒸干后,于105℃干燥5h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量。

2.5 多糖含量比較

2.5.1 試液配制 (1)0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制：精密稱取蒽酮0.2 g,加80%硫酸溶液100 m L使溶解,搖勻即得(棕色瓶保存或臨用時配制)。

(2)對照品溶液配制：精密稱取D-無水葡萄糖對照品0.01053g,置100 m L容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液(D-無水葡萄糖對照品使用以99.5%計,即每1 m L中含無水葡萄糖0.1044 mg)。

(3)供試品溶液配制：取白及樣品1粉末約0.5 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加入150m L水加熱回流提取1h,趁熱用布氏漏斗濾過,殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次,每次10 m L,合并濾液和洗液,放冷,轉移至250 m L量瓶中,加水至刻度,搖勻,溶液濾過,精密量取續濾液0.5 m L加入4 m L丙酮,搖勻,靜置10 min,離心,倒去上清液,沉淀加水溶解,轉移至10 m L量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得。

2.5.2 顯色條件確定 精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液0.2m L,置10m L具塞試管中,加水至2m L搖勻；供試品溶液2 m L,置10 m L具塞試管中。冰水浴中緩緩滴加蒽酮-硫酸溶液6 m L,搖勻,沸水浴10 min,冰水浴10 min,以相應試劑為空白,625 nm波長下測量吸光度。見圖4。

圖4 白及全波長掃描

2.5.3 線性關系考察 分別量取0.284 mg/m L的D-無水葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.8m L于10m L具塞試管中,加水至2 m L,搖勻,在冰水浴中緩緩滴加6 m L 0.2%蒽酮-硫酸溶液,搖勻,沸水浴10min,冰水浴10 min,在625 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標Y,葡萄糖濃度為橫坐標X,所得標準曲線為：Y=6.3732X-0.0464,R2=0.9983。

2.6 militarine含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm,5μm),檢測波長223 nm,柱溫40℃,流速1.0 m L·min-1,進樣量10μL,流動相甲醇-水(63∶37)。

2.6.2 對照品溶液制備 精密稱取militarine對照品適量,加甲醇溶液制成每1m L含0.813mg對照品的溶液。

圖5 對照品及樣品圖譜

2.6.3 供試品溶液的制備 取本品粉末0.2 g,精密稱定,精密加入甲醇50 m L,稱重,加熱回流2 h,放冷,用甲醇補足減失重,搖勻,濾過,取續濾液作為供試品溶液。對照品及樣品圖譜見圖5。水分、灰分、浸出物、多糖、militarine含量對比見表2及圖6。

表2 野生白及和栽培白及比較

圖6 野生白及和栽培白及比較

2.6.4 線性關系考察 精密稱取militarine對照品,加甲醇制成每1 m L含0.8130 mg對照品的儲備液,分別精密量取對照品儲備液0.2、0.5、1、2、4 m L置5 m L量瓶中,分別加甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻。分別精密吸取10μL儲備液,注入液相色譜儀,以峰面積(Y)為縱坐標,進樣濃度(X)為橫坐標,繪制工作曲線計算回歸方程：Y=107X+18453,r=0.999 9。結果表明militarine進樣量在0.32～6.37μg間線性關系良好。

2.6.5 精密度試驗 精密稱取同一批白及粉末0.2 g,按“2.5.3”項下方法制備白及供試品溶液,并按“2.5.1”項下色譜條件,連續重復進樣6次,測定峰面積。militarine的峰面積RSD為0.19%,顯示儀器精密度良好。

2.6.6 重復性試驗 精密稱取同一批白及粉末6份,各0.2g,按 “2.5.2”項下方法制備白及供試品溶液,并按“2.5.1”項下色譜條件進樣,測定峰面積。結果militarine含量的RSD為0.70%,表明重復性良好。

2.6.7 穩定性試驗 精密稱取同一批白及粉末0.2 g,按“2.5.2”項下方法制備白及供試品溶液,并在“2.5.1”項下色譜條件分別于0、1、2、4、8、12 h進樣,測定峰面積。結果militarine峰面積RSD為0.28%,結果表明白及供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 鉛、砷、鎘、汞、銅五種元素的含量測定

2.7.1 標準品儲備溶液的制備 精密量取鉛、砷、鎘、汞、銅單元素標準溶液,用10%硝酸溶液稀釋制成每1 m L分別含鉛、砷、鎘、汞、銅元素1μg、0.5μg、1μg、1μg、10μg的溶液。

2.7.2 標準品溶液的制備 精密量上述儲備液,用10%硝酸溶液稀釋,制成每1 m L含鉛、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng、20 ng,含鎘0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5 ng、10 ng,含銅0 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列濃度混合溶液。另取汞儲備液,用10%硝酸溶液稀釋制成每1 m L分別含汞0 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng的溶液。

2.7.3 內標溶液的制備 精密量取鍺、銦、鉍單元素標準溶液適量,用水稀釋制成每1m L含鍺、銦、鉍元素1μg的混合溶液。

2.7.4 供試品溶液的制備 精密稱定白及粉末約0.2 g,加硝酸6m L消解,消解完全后冷卻至60℃,消解液轉入50 m L量瓶中,用少量水洗滌消解罐,合并于量瓶中,加入金單元素標準溶液(1μg/m L)200μL,搖勻,即得。

2.7.5 樣品測定 線性回歸方程見表3。野生白及和栽培白及鉛、砷、鎘、汞、銅5種元素的含量范圍及均值見表4。用SPSS21.0軟件對野生和栽培白及5種元素含量進行獨立樣本t檢驗,結果見表6。由表6知,除銅元素外,其他4種元素在野生和栽培品中沒有顯著性差異。

表3 白及五種元素回歸方程和相關系數

表4 白及5種微量元素含量對比 (mg/kg)

3 結論

本研究以入藥部位白及塊莖為研究對象,比較了野生白及和栽培白及的性狀、薄層鑒別、水分、灰分、浸出物、多糖和militarine含量、微量元素等幾方面的內容,發現由于生長環境不同,白及性狀有一定差異,本研究為以后的藥材鑒別提供了依據。野生白及的水分、灰分、militarine含量高于栽培白及,而浸出物、多糖含量值低于栽培白及,二者水分、灰分均符合藥典要求。在多糖含量方面,野生品低于栽培品,多糖是白及中主要成分,對于血液系統、消化系統、免疫系統、抗腫瘤和抗菌都有良好的藥效,因此在多糖含量方面栽培品可以替代野生品。本研究比較了熱浸法、冷浸法以及不同濃度乙醇(50%、70%、80%)測定白及浸出物的效果,結果熱浸法和冷浸法均不能過濾,50%乙醇浸出物含量18.9%,70%乙醇浸出物含量11%,80%乙醇浸出物含量12.6%,所以最后采用50%乙醇進行浸出物測定。在白及塊莖中含有的微量元素,依據含量排名：Cu＞Pb＞As＞Cd＞Hg,說明白及塊莖對Cu的富集能力最強,對汞的富集能力最弱,二者有顯著性差異。所以在栽培時應注重栽培條件,減少含Cu農藥和肥料的使用。本課題通過對野生和栽培白及進行多項研究,為合理保護野生白及資源,加強白及栽培技術的推廣,開展白及的野生資源保護提供了重要參考依據。

表5 5種微量元素獨立t檢驗