散瘀止痛凝膠膏劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張玉娥,王賢兒,關(guān)琴笑,石楚婷,谷 捷,譚娥玉

(1.江門市五邑中醫(yī)院/暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第六附屬醫(yī)院 藥學(xué)部,廣東 江門529000；

2.江門市五邑中醫(yī)院/陳皮研究院,廣東 江門529000；3.廣東藥科大學(xué),廣東 中山528400)

散瘀止痛膏為我院骨科院內(nèi)制劑,是有40余年歷史的骨傷科臨床經(jīng)驗(yàn)方,有較好的活血、祛瘀和消腫止痛的治療效果,臨床主要用于治療跌打損傷早、中期瘀腫疼痛等外傷。原處方為大黃、兩面針、千里光等五種藥材制成粉末后與凡士林混合制成軟膏,供臨床患者外敷或涂抹使用。在長期使用過程中發(fā)現(xiàn)此膏劑存在難以清洗、涂展不便、生物利用度低等缺點(diǎn),故決定對其進(jìn)行劑型改革：以親水性高分子聚合物作為載體,研制成新劑型——散瘀止痛凝膠膏劑,以改善其應(yīng)用中的諸多缺點(diǎn)[1]。目前,新劑型正在進(jìn)行臨床測試。同時為有效控制新制劑的質(zhì)量,本研究采用薄層鑒別色譜法對方中主要藥物大黃、兩面針進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法對大黃中有效成分進(jìn)行含量測定,旨在為新劑型建立簡便可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法?，F(xiàn)將研究過程報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TC-15套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；WH-800超聲波清洗機(jī)(濟(jì)寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SP-II型電動薄層點(diǎn)樣器(上?？普苌萍加邢薰?；HH-3A數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)；ME104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；WFH-203B三用紫外分析儀；Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ系列高效液相色譜儀(美國)；Shim-pack VP-ODS

C18色譜柱(250 L×4.6 mm,5μm)；硅膠G薄層板(自制)。

1.2 試藥

散瘀止痛凝膠膏劑(批號：20180117,20180118,20180119)及缺味陰性對照樣品由我院藥學(xué)部自制；大黃酸對照品(批號：MUST-17021310)購自中國科學(xué)院成都生物研究所；大黃藥材購自廣州市集芝寶中藥有限公司(批號：201708001)；硅膠G(批號：20161123)購自青島海洋化工有限公司；甲醇為色譜純(歐普森公司)；正己烷、乙酸乙酯、甲酸、二氯甲烷、石油醚(60～90℃)為分析純。

2 大黃薄層色譜鑒別

取本品20g,揭去蓋襯后,將其剪切成寬約0.5 cm的條塊狀,置于具硅膠塞的三角瓶中,加80 m L甲醇浸泡1h,超聲處理30 min,用定性濾紙濾過,將濾液蒸干,加蒸餾水10 m L使殘?jiān)芙?再加入1 m L鹽酸,在恒溫水浴鍋中加熱回流30 min,冷卻,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用乙醚萃取2次,每次20 m L,合并兩次乙醚液,揮干溶劑,加1 m L甲醇使殘?jiān)芙?作為供試品溶液。另取大黃對照藥材5 g,置于具硅膠塞的三角瓶中,大黃對照藥材的處理依照供試品溶液的制備方案制備,作為大黃對照藥材溶液。照薄層鑒別色譜法(附錄ⅣB)點(diǎn)樣,吸取上述溶液各10μL,點(diǎn)在同一塊以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為黏合劑的硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶4∶0.4)為展開劑,預(yù)飽和15 min,展開距離為15 cm,取出,晾干,最后置于紫外光燈(365 nm)下檢視,結(jié)果見圖1。

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性條件

Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 L×4.6 mm,5 m)；流動相：甲醇(A)-0.2%磷酸(B),梯度洗脫(0～30min：70%A～85%A；30%B～15%B)；流速：1.0m L/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20μL。理論塔板數(shù)按大黃酸峰面積計算應(yīng)不低于3 000。取大黃酸對照品溶液、散瘀止痛凝膠膏劑供試品溶液和陰性缺大黃對照溶液,依照上述色譜條件進(jìn)樣檢測,發(fā)現(xiàn)大黃酸對照品溶液與散瘀止痛供試品溶液在一致的保留時間處均出現(xiàn)了大黃酸的吸收峰,缺大黃的陰性對照溶液在對應(yīng)的保留時間處無吸收峰。檢測結(jié)果表明,大黃酸的色譜峰分離度良好,R＞1.5。見圖2、圖3、圖4。

圖1 大黃的薄層色譜

3.2 對照品溶液的制備

精密稱定適量的大黃酸對照品,加入甲醇制成每1 m L含有0.023 mg的大黃酸對照品溶液,搖勻即得。

3.3 供試品溶液的制備

精密稱取散瘀止痛凝膠膏劑5 g,加甲醇30 m L,水浴加熱回流30min,放冷,用定量濾紙濾過,用少量甲醇洗滌濾紙和濾器,合并濾液置于50 m L棕色容量瓶中,定容,密塞,搖勻,吸取上述母液25 m L,蒸干,殘?jiān)?%鹽酸25 m L,超聲處理10min,加二氯甲烷25m L,加熱回流1h,放冷后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,靜置分層,重復(fù)萃取3次,合并下層液,回收有機(jī)溶劑,加甲醇溶解殘?jiān)⑾♂屩?0 m L,密塞搖勻,過0.45μm濾膜,即可。

3.4 陰性對照溶液的制備

按方中比例稱取缺大黃的各味藥材,按照散瘀止痛凝膠膏劑的提取工藝和制備工藝制成不含大黃的散瘀止痛凝膠膏劑,依“3.3”項(xiàng)的制備方法制備缺大黃陰性對照溶液。

圖1 大黃酸對照品溶液

圖4 散瘀止痛凝膠膏劑陰性對照品溶液(缺大黃)

3.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取大黃酸對照品溶液1、5、10、20、25、30μL,依“3.1”項(xiàng)進(jìn)樣測定,記錄不同進(jìn)樣體積下的峰面積,以峰面積(Y)和進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸,得出大黃酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=513.8607X+3.1332(r=0.999 9)。結(jié)果表明大黃酸在進(jìn)樣量0.23～1.38μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一大黃酸對照品溶液,依照“3.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定每次進(jìn)樣后的大黃酸峰面積,經(jīng)計算得出RSD為0.6%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一批次散瘀止痛凝膠膏劑供試品溶液,依照“3.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測,將樣品溶液分別放置0、2、4、8、16、24 h后進(jìn)樣檢測,檢測不同放置時間下的峰面積,計算大黃酸含量,結(jié)果RSD為1.74%,表明供試品溶液能在24 h內(nèi)維持穩(wěn)定狀態(tài),有較好的穩(wěn)定性。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批次散瘀止痛凝膠膏劑6份,依照“3.3”項(xiàng)制備方案制成供試品溶液,依照“3.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測,測得供試品溶液中大黃酸平均含量,經(jīng)計算得出重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為1.18%,表明試驗(yàn)方法有良好的重復(fù)性。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取同一批次已知含量的散瘀止痛凝膠膏劑6份,精密稱取5 g,分別置于磨口三角瓶中,精密加入適量的大黃酸對照品溶液,依照“3.3”項(xiàng)的制備方法制成供試品溶液,依照“3.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測,測定大黃酸的峰面積,經(jīng)計算得出回收率RSD為1.25%,標(biāo)明試驗(yàn)方法加樣回收率較優(yōu)。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.1 0 樣品含量測定

取10批散瘀止痛凝膠膏劑樣品(批號：20171010、20171013、20171014、20180117、20180118、20180119、20180420、20180421、20180623、20180624),依照“3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成3批樣品溶液,按“3.1”項(xiàng)進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在大黃酸的含量測定中原采用藥典方法,即等梯度洗脫[2],但由于供試品中目標(biāo)峰與雜峰分離度低,且峰型不佳,因此嘗試甲醇(A)-0.2%磷酸(B),梯度洗脫(0～30min：70%A～85%A；30%B～15%B),并且加大磷酸濃度以調(diào)整其峰型,最終得到含量測定方法。

此外,本實(shí)驗(yàn)在凝膠膏劑供試品溶液處理過程中考察了樣品提取時是否采用萃取。結(jié)果表明,未經(jīng)過萃取的溶液里面含有部分膏劑基質(zhì),且含有的雜質(zhì)較多,導(dǎo)致在點(diǎn)樣時容易堵塞毛細(xì)管,嚴(yán)重影響點(diǎn)樣的操作,因此筆者認(rèn)為對于凝膠膏劑、凝膠劑等以高分子聚合物為基質(zhì)的制劑,在提取制備供試品時,最好有適當(dāng)?shù)妮腿〔襟E,以純化樣品,方便點(diǎn)樣和分析。