懷菊總黃酮提取工藝優化及不同花期總黃酮積累規律研究

夏 偉,譚政委,梁慧珍,余永亮,楊紅旗,許蘭杰,董 薇

(河南省農業科學院 芝麻研究中心,河南 鄭州450002)

懷菊是我國常用大宗藥材之一,2015版《中國藥典》記載懷菊為菊科菊屬植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥頭狀花序,具有疏散風熱、清肝明目、清熱解毒的功效,常用于用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛,眼目昏花[1]。懷菊中含有黃酮類、萜類及有機酸類等活性化合物,其中的黃酮類化合物包括黃酮類、黃酮醇、二氫黃酮類等,具有抗氧化、抗炎、鎮痛、調節免疫、抗衰老、降血脂、抗腫瘤等藥理作用[2-3]。懷菊主產于安徽、河南、浙江、河北、湖北等地,且2015版《中國藥典》藥用懷菊記錄懷菊入藥為“毫菊”“滁菊”“貢菊”、“杭菊”“懷菊”5個品種,主要以栽培為主,市場需求量較大[4]。目前許多科研工作者的研究主要集中在懷菊的藥理學活性成分分析上。本研究以懷菊為材料,優化懷菊總黃酮的提取工藝,比較開花時期懷菊的總黃酮積累規律,以期為懷菊質量控制及采收加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

懷菊及不同花期懷菊均采自河南省農業科學院現代農業研究開發基地(N 35°0'36″,E 113°42'24″),經河南省農業科學院芝麻研究中心藥用植物研究室梁慧珍研究員鑒定為菊科植物懷菊。不同花期確定根據其采收時懷菊開放程度共分為5個時期。見表1。

表1 懷菊不同花期性狀

蘆丁對照品(國藥集團化學試劑有限公司,批號：20160725,純度＞95%),無水乙醇(天津四友化學有限公司,分析純),無水三氯化鋁(天津市風船化學試劑科技有限公司,分析純),亞硝酸鈉(天津市大森化工產品銷售有限公司,分析純),氫氧化鈉(天津市華東試劑廠,分析純)。

美譜達UV-3200紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司),KQ3200DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 對照品溶液配制：精密稱取經過120℃干燥至恒重的蘆丁標準品0.020 7g,用甲醇定容至100 m L,配制成濃度為0.207mg/m L的標準應用液。供試品溶液配制：稱取0.250 0 g懷菊粉末(四號篩),精密加入70%乙醇溶液25m L,超聲(105W,40k Hz)條件下超聲35 min,過濾即得。

1.2.2 測定方法的建立 優選測定方法[7-9]：本實驗主要對NaNO3-AlCl3、AlCl3、KOH和直接法對懷菊總黃酮進行測定。

波長篩選：在相同樣品處理條件下,利用全波長掃描,掃描每種方法項下的標準液和樣品液,綜合確定每種方法最優波長。

NaNO3-AlCl3法：精密吸取0.5 m L樣品溶液,置于10 m L具塞試管中,加70%乙醇至5 m L,加入0.3 m L,5%NaNO3溶液,搖勻,靜置6 min,后續加入0.3 m L,10%AlCl3溶液,搖勻,靜置6 min,最后加入4 m L,1.0 mol/L NaOH溶液,分別用70%乙醇稀釋至刻度,搖勻靜置15min,于510nm下測定吸光度值。

AlCl3法：精密吸取0.5m L樣品溶液,置于10m L具塞試管中,加入2%AlCl3溶液1m L,用70%乙醇稀釋至刻度,靜置20min,分別于300 nm和410 nm條件下測定吸光度值。

KOH法：精密吸取1m L樣品溶液,置于10m L具塞試管中,用70%乙醇稀釋2m L,加10%KOH溶液0.5m L,充分混勻,靜置顯色5 min,用70%乙醇稀釋至刻度,于280 nm、340 nm和410 nm條件下測定吸光度值。

直接測定法：精密吸取0.5 m L樣品溶液,置于10 m L具塞試管中,用70%乙醇稀釋至刻度,充分混勻,靜置5 min后于306 nm和358 nm條件下測定樣品吸光度值。

1.2.3 懷菊總黃酮提取工藝優化[10-11]

單因素考察：稱取懷菊粉末(過四號篩)0.25 g,放入100 m L具塞玻璃錐形瓶中,指定工藝中一項指標變化,其他指標相同的條件下,進行單因素考察。每個樣品重復3次,樣品提取液經過濾、定容后測定其吸光度,計算懷菊樣品總黃酮與樣品重量的質量比,考察單因素對懷菊總黃酮提取效果的影響。正交試驗設計[10]：

根據單因素的試驗結果,選取對懷菊中總黃酮的提取效果影響較大的溶劑料液比、乙醇濃度、超聲時間、超聲功率4個影響因素,進行4因素3水平的正交試驗設計,見表2。

表2 懷菊總黃酮提取工藝條件的正交試驗設計

1.2.4 不同花期總黃酮積累規律研究[5-6]選取正交設計優化的提取工藝,測定不同花期、不同部位總黃酮含量,考察不同花期總黃酮積累規律。

2 結果與分析

2.1 測定方法

在料液比為1∶100,乙醇濃度為50%,超聲功率為90 W,超聲20 min條件下,在對應波長吸收峰條件下,對NaNO3-AlCl3、AlCl3、KOH和直接法對懷菊總黃酮進行測定,結果見圖1。由結果可知,在310 nm條件下AlCl3測定條件測定含量最優,因此選擇AlCl3在310 nm條件為懷菊總黃酮測定方法。

圖1 不同測定方法含量結果

2.2 提取工藝條件對懷菊總黃酮提取效果的影響

2.2.1 單因素對懷菊總黃酮提取效果的影響 乙醇濃度：本實驗選用常規試劑乙醇,在料液比為1∶100,超聲功率為90 W,超聲時間20 min條件下對不同體積分數的乙醇提取試劑提取懷菊總黃酮。由圖2可知,乙醇濃度為80%時對懷菊總黃酮的提取效果最好,濃度再增加提取效率降低。

圖2 乙醇濃度對懷菊總黃酮提取效果的影響

料液比：在功率為90 W,超聲時間20 min,乙醇濃度為80%條件下考察不同料液比提取懷菊總黃酮的影響,結果見圖3。由結果可知,不同料液比提取效率有差異,在1∶30～1∶150條件下提取效率逐漸升高,之后開始降低,因此選擇料液比為1∶150。

圖3 料液比對懷菊總黃酮提取效果的影響

超聲時間：在功率為90 W,乙醇濃度為80%,料液比為1∶150條件下考察超聲時間對提取懷菊總黃酮的影響,結果見圖4。由圖4結果可知,隨著超聲時間的延長,懷菊總黃酮提取效率呈現上升趨勢,至30 min效果最好,隨后開始降低,因此選擇超聲時間為30 min。

超聲功率：超聲功率的變化可明顯影響植物有效成分的溶出。因此在乙醇濃度為80%,料液比為1∶150,超聲時間30min條件下考察超聲功率對提取懷菊總黃酮的影響,結果見圖5。由結果可知,在超聲功率為105 W條件下總黃酮提取效率最高,因此選擇超聲功率為105 W。

圖4 超聲時間對懷菊總黃酮提取效果的影響

圖5 超聲功率對懷菊總黃酮提取效果的影響

2.2.2 桑白皮總黃酮提取工藝條件的優化 在單因素試驗的基礎上,本實驗選擇提取試劑濃度、料液比、超聲功率、超聲時間為考察因素,采用4因素3水平的正交設計對懷菊總黃酮提取工藝進行優化,結果見表3。由表3中實驗數據及極差R的大小可判斷出4個因素對懷菊總黃酮提取效果因素影響的主次順序為：料液比 ＞ 乙醇濃度 ＞ 超聲功率 ＞ 超聲時間。因此最佳提取工藝條件為A1B2C3D2組合,即料液比1∶100,乙醇濃度80%,超聲時間40 min,超聲功率105 W。在此工藝條件下提取懷菊總黃酮樣品的質量比為16.6188 mg/g。

表3 懷菊總黃酮提取工藝條件的L 9(34)正交試驗結果

2.2.3 不同花期懷菊總黃酮積累規律 S1～S5五個時期懷菊總黃酮有表4和圖6可知,S1～S5五個時期總黃酮含量差異顯著,且懷菊花蕾期總黃酮含量較高,達到16.5701mg/g,隨著懷菊逐漸開放,至S3時期懷菊總黃酮含量一直減少,S4期懷菊達到盛開期,總黃酮含量又顯著的增加,此時含量為15.826 4 mg/g,隨著懷菊開始枯萎,其總黃酮含量又開始下降。由S1～S5不同時期懷菊總黃酮積累曲線可知,懷菊總黃酮在其生長階段總黃酮含量也在時刻變化,有升有降,且在懷菊采收期階段又有一個顯著的積累過程,這也與傳統懷菊采收期結論一致。

表4 懷菊S1～S5總黃酮含量 (±s,mg/g)

表4 懷菊S1～S5總黃酮含量 (±s,mg/g)

注:小寫字母表示P＜0.01。

花期 總黃酮S1 16.5701±0.0316a S2 14.5253±0.02193b S3 14.3803±0.2286c S4 15.8264±0.0031 d S5 14.7894±0.1345e

圖6 懷菊不同花期總黃酮積累曲線

3 討論

懷菊在我國栽培歷史悠久,藥用價值突出,是河南產區著名的四大懷藥之一,亦是傳統中藥材懷菊的重要來源之一。因此,本研究主要選取具有代表性的懷菊品種小黃菊為實驗材料,在對4種紫外分光光度測定方法的對比中,獲得懷菊總黃酮最佳方法是300nm條件下AlCl3測定法；在單因素試驗的基礎上通過正交試驗設計,獲得懷菊總黃酮的最佳提取工藝條件為料液比1∶100,乙醇濃度80%,超聲時間40min,超聲功率105W；根據懷菊開放程度的不同,將懷菊劃分為5個時期,在對5個時期總黃酮含量測定中發現,懷菊不同時期總黃酮積累程度差異明顯,且在盛花期時總黃酮有一個明顯的積累過程。

目前總黃酮提取技術較為成熟,但在懷菊的應用上較為少見。另外在紫外分光光度法分析測定總黃酮時測定方法較為單一,很少有幾種方法進行對比優選。懷菊黃酮類成分是其有效成分,懷菊在其開放過程中,花顏色的變化、花開放的程度以及花的香味等都有變化,變化過程中懷菊總黃酮含量的變化是否與其有關,值得后期進一步研究。