正交法配合藥效實驗綜合優選蛤蚧酒制工藝

劉舒凌,黃馨慧,熊桂玉,張 兵,王曉珊

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧530001；2.廣西國際壯醫醫院,廣西 南寧530021)

蛤蚧為壁虎科動物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)除去內臟的干燥全體,其味咸性平,歸肺、腎經,具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效[1]。酒蛤蚧是蛤蚧飲片的形式之一。蛤蚧酒制后質酥易碎,矯臭矯味,可增強補腎壯陽的功效。2015版《中國藥典》[2]收載酒蛤蚧飲片的炮制方法為取蛤蚧塊,用黃酒浸潤,烘干。目前,酒蛤蚧的具體炮制加工技術參數,如加輔料量、烘制溫度、烘制時間等,藥典中未作規定,全國和省級中藥飲片炮制規范的規定亦不統一。本研究擬采用正交試驗考察蛤蚧酒制過程中影響成品質量的因素(加輔料量、烘制溫度、烘制時間),選取浸出物含量、總蛋白質含量和腎陽虛小鼠藥效學指標對蛤蚧酒制工藝進行綜合評價分析,以期優選酒蛤蚧飲片的最佳炮制工藝,為酒蛤蚧飲片的規范化生產提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗藥物

蛤蚧購自廣西南寧市浚豪野生動物養殖場,經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室田慧教授鑒定為壁虎科動物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)的原藥材。特醇紹興花雕酒(浙江省塔牌紹興酒有限公司,批號：20160327)；腺嘌呤(日本Sigma公司,批號A8330)；金匱腎氣丸(北京同仁堂制藥廠,批號：15042706)。

1.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠,雄性,體重28～32g,購自廣西醫科大學實驗動物中心,許可證號：SCXK桂2014-0002。

1.3 實驗儀器

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣儀器廠)；BP211D型電子天平(德國賽多利斯公司)；1100型凱氏定氮儀(濟南海能儀器公司)。

2 方法與結果

2.1 蛤蚧飲片制備

取蛤蚧原藥材,除去內臟,烘干,除去頭(齊眼處切除)、足、鱗片,切成小塊,即得蛤蚧的生品飲片,備用。

2.2 酒蛤蚧飲片炮制工藝的正交試驗設計

取蛤蚧飲片作為實驗材料,每份100 g,在單因素考察的基礎上,以加酒量、烘制時間、烘制溫度為考察因素,設計L9(33)因素水平表。見表1。

2.3 指標性成分含量測定

2.3.1 浸出物含量測定[3]按照《中國藥典》醇溶性浸出物測定法(通則2201)項下的冷浸法測定：取酒蛤蚧樣品約4g,精密稱定,置于250 m L錐形瓶中,精密加稀乙醇100 m L,密塞,冷浸,前6 h內時時振搖,再靜置18 h,用干燥濾器迅速濾過,精密量取續濾液20 m L,置于已干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上蒸干后,于105℃下干燥3 h,置于干燥器中冷卻30min,迅速精密稱定重量,以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.3.2 蛋白質含量測定[4]按照《中國藥典》四部蛋白質含量測定法(通則0731)項下的第一法凱氏定氮法測定總氮值,分別乘以換算因子6.25,計算得蛤蚧的總蛋白質含量。

表1 酒蛤蚧炮制因素水平

2.4 對腎陽虛小鼠的影響

2.4.1 酒蛤蚧飲片供試品制備 取正交設計的9份酒蛤蚧生品飲片各50g,剪碎,打粉,研細后過二號篩,備用。

2.4.2 腎陽虛小鼠指標測定 取雄性健康小鼠120只,留取10只作為正常組小鼠,其余110只小鼠每日ig.腺嘌呤[5](100 mg/kg),連續給藥7d制備腎陽虛模型。造模成功后,將110只小鼠分為模型組、陽性對照組(金匱腎氣丸),9個酒蛤蚧飲片組。正常組和模型組小鼠ig.蒸餾水,陽性組小鼠ig.金匱腎氣丸2g/kg；各酒蛤蚧飲片組小鼠ig.相應酒蛤蚧飲片粉末,以蒸餾水稀釋,劑量為1 g/kg,連續給藥10 d。末次給藥后小鼠禁食不禁水,12 h后稱取體質量。脫頸椎猝死后,分離小鼠腎臟、睪丸,將腎臟、睪丸用生理鹽水洗凈,濾紙拍干,于分析天平上稱定質量,計算臟器指數(臟器指數=臟器質量/小鼠體質量×1000)。

2.5 實驗結果

以測定的浸出物含量、蛋白質含量以及藥效指標腎臟指數、睪丸指數作為考察指標,綜合加權評分確定酒蛤蚧的炮制工藝。正交試驗設計表及結果見表2,方差分析見表3。

表2 酒蛤蚧炮制正交實驗安排及結果

表3 蛤蚧酒制綜合評分方差分析

由正交試驗方差分析結果可知,酒制蛤蚧的影響因素主次大小為C(烘制溫度)＞A(加酒量)＞B(烘制時間),烘制溫度對結果有顯著影響。根據直觀分析可確定蛤蚧的最佳炮制工藝為A3B3C1,即蛤蚧飲片加入0.3倍量黃酒(每100g蛤蚧飲片加入30g黃酒),烘制2 h,溫度80℃。

2.6 驗證試驗

按照優選的酒制工藝制備2份樣品,測定浸出物含量、蛋白質含量,檢測腎陽虛小鼠腎臟指數、睪丸指數,以驗證酒制工藝是否可行。結果見表4。

表4 驗證實驗

由表4可知,2份酒蛤蚧樣品中浸出物含量和蛋白質含量均較高,腎臟指數和睪丸指數較好,與正交試驗結果吻合,說明本實驗優選的酒制工藝可行。

3 討論

蛤蚧的炮制方法最早見于南北朝的《雷公炮炙論》中,雷公曰：“凡修事,服之去甲上、尾上并腹上肉毛,毒在眼,如斯修事了,用酒浸,才干,用紙兩重于火上緩隔焙紙炙。”(凈制,酒浸烘焙法)。現代蛤蚧的炮制方法多為凈制、酒制,對應的飲片品種為蛤蚧、酒蛤蚧。生蛤蚧的功效以補脾益肺、納氣定喘為主。酒制蛤蚧可增強補腎壯陽的功效,多用于腎陽不足、精血虧損所致的陽痿、五更泄瀉、小便頻數等病癥的治療[6]。目前國內對蛤蚧的炮制研究主要集中在蛤蚧頭、體、尾不同藥用部位的化學成分和藥效學方面[7-9],而對蛤蚧的炮制工藝研究還未見系統研究與報道。

現代研究表明,蛤蚧的化學成分包括甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸等14種氨基酸,鈣、磷、鋅等18種元素,以及肌肽、膽堿、鳥嘌呤、磷脂等。其藥理作用為抗應激、抗炎、增強免疫、平喘、雌性激素樣、雄性激素樣、延緩衰老等[1]。由于目前蛤蚧的指標性成分尚不明確,在進行質量分析時常以氨基酸含量、浸出物含量為指標成分[9]。然而僅以某些化學成分的高低難以評判炮制工藝的好壞以及揭示炮制的原理和意圖。多指標設計將現代有效成分以及藥效等多指標結合進行綜合評價,是目前研究炮制工藝和原理的常用方法。由于蛤蚧酒制的主要目的為增強補腎助陽功效。本課題在進行炮制品成分含量測定的同時,配合采用腎陽虛動物模型,以成分結合藥理指標綜合篩選蛤蚧的酒制工藝具有實際意義。根據工藝篩選結果,確立最佳工藝為蛤蚧飲片加入0.3倍量黃酒,潤透后,烘制2 h,溫度80℃。

雖然規范蛤蚧飲片的炮制工藝具有必要性,但是蛤蚧藥材的質量控制也十分重要。實驗前期調研發現,市售蛤蚧藥材的體型大小、肉質厚薄差異較大,浸出物和蛋白質含量也參差不齊。本實驗選取產于廣西的蛤蚧鮮藥材進行加工炮制,其肉質較厚,含量檢測發現其蛋白質含量較高。本試驗優選的工藝對于不同產地、不同肉質厚薄之蛤蚧是否適用仍需多樣本系統性考察確定,有待進一步實驗研究。