瘡靈液對鼠永生化黑素細胞黑素生成的影響

周瀲，彭皖蘇，周夢圓，蔣佳風,徐萍,譚城*

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學第一附屬醫院 江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029)

白癜風是一種易診難療的色素減退疾病，自古以來，世界各個國家運用不同性質和效果的草藥提取物治療色素性疾病：銀杏葉提取物、甜瓜、阿米芹種子提取物凱林、阿育吠陀醫學中胡黃連、水龍骨提取物(青蓮提取物)、綠茶多酚、辣椒素、姜黃色素、橙色喇叭花以及傳統中醫中藥[1]。隨著社會進步和信息化的發展，傳統中醫中藥治療已經走出國門，被全世界認可和接受:通過結合局部或全身UVA光照與補骨脂種子提取物聯合運用的治療方法(PUVA療法)其作用機制及其療效已被國際社會認可[1]。不僅僅是單味中藥，中醫還曾嘗試用不同的復方草藥產品治療白癜風。用于白癜風的復方外用制劑治療也已經在體內和體外獲得了明確的藥物功效。特別是祖國醫學分支維吾爾醫學中最常用的白癜風治療方“Barres復方”。該制劑由五種草藥(補骨脂、白花丹、薺菜、黑種草和驅蟲斑鳩菊)的高溫水提取物組成[2]。 在國外最新兩項研究中表明其復方干預的白癜風皮損創面已經觀察到良好的色素沉著和復色，推測其能刺激黑素細胞的黑素生成[3]。瘡靈液也是一種純中藥外用藥液，功效為活血化瘀、解毒，收斂生肌,由南京中醫藥大學第一附屬醫院即江蘇省中醫院在上世紀80年代研制，主要由大黃、紅花、訶子、黃蜀葵花等組成，全方配伍，具有化瘀活血、收斂生肌、止痛消腫之效，符合中醫治療白癜風補益肝腎、活血化瘀為主的治療大法。瘡靈液安全性能較好，無毒無肝損，高效抗炎，對各種慢性潰瘍及潰瘍伴有炎癥療效顯著[4]。臨床觀察到瘡靈液治療后的創面皮損色素有所加深，療效類似于近期對于“Barresi復方”的研究推測也有增加人黑素細胞的黑素合成的可能性,因而研究了瘡靈液對鼠永生化黑素細胞的作用，希望拓寬外用藥的適應范圍，為其治療白癜風等皮膚科疾病、走向國際醫學界提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

參照文獻[5]，瘡靈液原液(江蘇省中醫院研發自制，批號：1501001):設原液為1 g/mL，過濾除菌后分裝于15 mL離心管中，并置于-20℃存放待用，使用前完全培養液稀釋。完全培養液：F10培養液(Gibco)中加入59 ng/mL TPA(碧云天生物)及7%的馬血清(Gibco)，混勻后于4℃存放。1% TritonX-100溶液：5 mL的PBS(Hyclone)溶液吸棄50 μL等體積加入50 μL TritonX-100，配制成5 mL的1%TritonX-100溶液。L-Dopa溶液：少量L-Dopa(Sigma)1M稀HCl溶解繼續用 PBS溶液稀釋，配平L-Dopa濃度至2 g/L。10%DMSO-NaOH溶液配制：2 gNaOH(Sigma)用ddH2O50 mL稀釋到1 mol/L，棄去5 mL后等體積加入5 mLDMSO溶液，混合成含10%DMSO-NaOH混合液。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

凍存的鼠永生化黑素細LIOBIOBR-GFP(ATCC?CRL-2770TM)于恒溫水浴箱中快速融化，然后室溫低速離心機1 100 r/min離心6 min，加入5 mL完全培養液，吹打混勻后，種于10 cm培養皿，然后移入培養箱，第二天，倒置顯微鏡40倍鏡下觀察細胞貼附及生長狀態，若細胞狀態良好，此后約2 d換1次培養液[5]。細胞長到皿底60%面積后傳代，按1∶3比例，傳代后置于培養箱中繼續培育，待3～4代時取對數成長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 干預分組

從培養箱中取出傳代完的黑素細胞，先用無菌PBS液清洗2遍，后吸出PBS加入1 mL胰蛋白酶，1 min后消化完全后加入完全培養液2 mL終止消化，吸入離心管, 置于常溫低速離心機1 100 r/min離心5 min，1 mL移液器混勻，取10 μL加入10 μL臺酚藍混勻后于自動細胞計數板上機計數，稀釋細胞濃度到5×104/mL，每孔100 μl種到96孔板，培養箱繼續培育[5]。瘡靈液按比例加完全培養液稀釋，將其分別配制成50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL的相應溶液備用。24 h后吸出96孔板中的液體，加入各濃度的瘡靈液，單獨設一組無藥物的孔為空白對照孔，每一組設立5個復孔，放于培養箱中繼續培養，72 h后結束干預(黑素細胞形態見圖1～8)。

圖1 未給藥6孔板內黑素細胞(×40)

圖2 6孔板空白對照組黑素細胞(培養72 h后，×40)

圖3 6孔板(50 μg/mL)藥物劑量干預72 h黑素細胞(×40)

圖4 6孔板(100 μg/mL)藥物劑量干預72 h黑素細胞(×40)

圖5 6孔板(400 μg/mL)藥物劑量干預72 h黑素細胞(×40)

圖6 6孔板(800 μg/mL)藥物劑量干預72 h黑素細胞(×40)

圖7 6孔板(1 600 μg/mL)藥物劑量干預72 h黑素細胞(×40)

圖8 6孔板(3 200 μg/mL)藥物劑量干預后黑素細胞(×40)

1.2.3 黑素細胞增殖率的測定

采用MTT法測定其值。96孔板每孔分別加入50 μL1倍MTT溶液，放入37℃恒溫箱，4 h后小心棄去液體后每孔加入100 μL DMSO后放入搖床充分振蕩，10 min后待晶體溶解，置于酶標儀(預設490 nm)測量其吸光值[5]。重復以上實驗3次。細胞增殖率結果等于加藥組平均吸光值/空白組對照組吸光值(百分數)。

1.2.4 酪氨酸酶活性測定

96孔板棄掉液體，無菌PBS沖洗2遍后每孔加入l%TritonX-100試劑90 μL，然后放置于-80℃超低溫冰箱中反應，30 min后，取出待其恢復到室溫，每孔加入L-DOPA溶液10 μg，再放入37℃溫箱中充分反應90 min，取出于酶標儀測吸光值(475 nm波長)[5]。重復以上實驗3次。酪氨酸酶活性比率等于加藥組平均吸光值/空白對照組平均吸光值(百分數)。

1.2.5 細胞黑素含量測定

6孔板吸棄液體，無菌PBS沖洗2遍，每孔加入胰蛋白酶200 μL充分消化，培養液終止消化后1 100 r/min離心5 min，再加入PBS溶液繼續沖洗2遍沉淀。再加入配好的NaOH溶液，每管300 μL[5]。金屬浴100℃加溫30 min后冷卻至常溫，溶液混勻后移入96孔板中，放入酶標儀測吸光值(490 nm)，重復以上實驗3次[5]。預實驗將標準黑素按不同濃度加入96孔板測得黑素標準曲線，吸光值帶進標準曲線計算得出黑素濃度值(mg/mL)，黑素含量結果等于加藥組黑素濃度/空白對照組平均濃度(百分數)。

1.3 統計學方法

應用SPSS 24.0軟件處理并分析實驗數據，檢驗方差齊性后采用單因素方差分析比較差異性。結果若P<0.05為具有統計學上的差異，P<0.01是認為統計學上差異顯著。

2 結果

2.1 瘡靈液對于黑素細胞的增殖作用

由表1和圖9可知，瘡靈液低濃度(50 μg/mL)P值>0.05，高濃度(3 200 μg/mL)P值>0.05，說明最高和最低濃度的瘡靈液對細胞增殖無顯著作用;瘡靈液濃度在100～1 600 μg/mL時，有增進黑素細胞生殖的作用(P值均<0.05)，而且在100～400 μg/mL時，其作用成劑量依賴性遞增，在400 μg/mL時達到最大值。

表1 各濃度瘡靈液對黑素細胞增殖的作用

圖9 各濃度瘡靈液對黑素細胞增殖的作用

2.2 瘡靈液對黑素細胞中酪氨酸酶活性的作用

由表2及圖10可見，當為50 μg/mL(低干預濃度)，與空白組相比，黑素細胞酪氨酸酶活性(P值>0.05)無顯著統計學差異，對酪氨酸活性無明顯作用；瘡靈液濃度在≥100 μg/mL(高干預濃度)，均對酪氨酸酶活性有所增加(P值均<0.05)。特別在濃度在400 μg/mL以上，P值均<0.001，酪氨酸酶的活性顯著增強。圖10可見其對酪氨酸酶活性的影響大致也呈劑量依賴性遞增。

表2 各濃度瘡靈液對酪氨酸酶活性的作用

圖10 各濃度瘡靈液對酪氨酸酶活性的作用

2.3 瘡靈液對黑素細胞黑素合成的作用

由表3及圖11可見，50 μg/mL(低干預濃度)時，與空白組相比，黑素細胞黑素含量(P>0.05)無顯著統計學差異，瘡靈液在低濃度溶液對黑素細胞黑素生成無顯著作用；在≥100 μg/mL(高干預濃度)時，(P<0.05)差異顯著，黑素細胞的黑素合成均有所增加。

表3 各濃度瘡靈液對細胞黑素含量的作用

圖11 各濃度瘡靈液對黑素含量的作用

3 討論

白癜風影響世界0.5%的人口，是種后天慢性的損容類皮膚科疾病。白癜風以斑片狀脫色為特征，其特點在于表皮和皮膚其他組織中的黑素細胞全部或部分喪失，功能性黑素細胞喪失的主要病理生理學原因被認為包括遺傳易感性，自身免疫機制和氧化應激[6]。目前的現代醫學治療選擇主要基于三種方法：(1)使用局部和全身免疫調節劑(主要是皮質類固醇和鈣調神經磷酸酶抑制劑)調節自身免疫反應; (2)通過局部和全身抗氧化劑降低黑素細胞中的氧化應激;(3)使用光療法(特別是UVB)和色素細胞移植激活黑素細胞再生[6]。白癜風一般呈慢性發病，病程較長，雖不影響患者生理健康，但其皮膚脫色的特征通常導致美容缺陷和患者相當大的心理困擾或心理問題，臨床研究表明某些白癜風患者社會接受度降低的風險較高，生活質量也隨之降低，可以推斷這些患者更需要積極治療該疾病,以提高其生活質量和社會接受度[7]。

隨著現代醫學對中藥治療白癜風機制的研究，各種中藥外用制劑被開發出來。張春艷，許愛娥[8]根據中藥的療效、四氣五味、歸經所屬和現代臨床藥理學研究成果，對以往文獻中近30年來治療白癜風的常用外用方藥進行總結，統計得出結果: 補虛藥、活血化瘀藥、酪氨酸激活藥、光敏感藥在外用治療白癜風中最常用。酪氨酸酶濃度及活性大小干預著黑素細胞中合成的黑素含量的多少，是黑素合成中關鍵的限速酶[9]。通過實驗在臨床活血化瘀方藥中遴選出增加黑素生成的中藥具有潛在的應用。瘡靈液，是一種主要由大黃、訶子、紅花、黃蜀葵花組成的外用中藥制劑。許振毅[10]等研究得出大黃三種有效成分對酪氨酸酶的調節呈雙向作用：蘆薈大黃素(低劑量)提高細胞70%的酪氨酸酶活性，大黃次酸(高劑量)提高了細胞81%的酪氨酸酶活性，大黃素甲醚對酪氨酸酶的活性促進作用呈濃度依賴性。張理平[11]確定了酸性中藥中28味成分提取物對黑素合成影響，其中訶子對酶活性影響呈在高濃度溶液時抑制，中、低濃度增加的雙向作用。紅花是傳統中醫常用的活血化瘀藥，姜麗莎[12]等用主要成分為紅花的院內自制擦劑干預豚鼠模型，結果顯示復方紅花酊高至中劑量治療組有明顯療效，其機理可能是令一種重要的前炎性細胞因子TNF-α和免疫相關連的白介素因子IL-10的表達上升，進一步促進黑素合成和免疫抗氧化的調節來達到皮損色素沉著和復色的治療目的。

氧化應激也是白癜風生成的重要病理機制，氧化應激可能觸發通過黑素細胞自分泌釋放HMGB1(一種晚期炎癥介質)，抑制黑素細胞的表達Nrf2(一種保護細胞免受氧化損傷的關鍵因素)和下游抗氧化應激基因，直接或間接導致黑素細胞凋亡，參與白癜風的病理發病過程[13]。黃蜀葵花提取物具有良好的抗氧化性能和防止細胞內線粒體損傷功能，黎望[14]研究顯示黃蜀葵花的主要成份黃酮類物質在0.04至0.60 mg/mL濃度時，對-OH 和H2O2導致的DNA氧化損傷都能起到保護作用，在0.12 mg/mL濃度時，對DNA損傷的保護作用最強。由此推測黃蜀葵花可能作用于白癜風氧化應激的病理機制以達到治療的療效。

綜上，瘡靈液的幾種成分均有相關文獻研究支持，理論上我們推測其可以從不同機制作用于黑素細胞達到治療白癜風的效果。此前，瘡靈液主要運用在促進創口愈合：許巖磊[15]等研究出瘡靈液可以減少潰瘍處炎癥相關蛋白酶釋放的同時增強組織基質生成的作用機理。張媞[16]等研究了瘡靈液外用促進漿細胞性乳腺炎傷口愈合的療效，得出瘡靈液能夠可以降低潰瘍面IL-2、IL-4、IL-6等炎癥因子從而減損傷處炎性癥狀,緩解疼痛,改善局部皮損病理和皮膚生理,減小腫塊大小從而幫助組織再生。至今為止，在基礎研究方面，瘡靈液用于白癜風治療存在空白。臨床中我們觀察到瘡靈液治療后的創面，不但愈合良好，甚至有些原皮損處色素有所加深。根據臨床現象作者研究了瘡靈液干預后，小鼠永生化黑素細胞(ATCC?CRL-2770TM)增殖率，酪氨酸酶活性以及黑素合成的改變，研究得出瘡靈液對此三項指標均有增進作用。所以作者推測在黑素細胞黑素合成方面瘡靈液對鼠永生化細胞具有一定的增進作用。本研究為瘡靈液用于治療白癜風等色素減退性疾病提供了理論依據，不足之處如：具體作用機制、有效成分及其劑量尚待進一步研究。