滋水清肝理沖飲對(duì)EMs小鼠應(yīng)用GnRHa后體質(zhì)量和曠場(chǎng)行為的影響

馬小娜，李冰冰，閆軍堂，任國(guó)輝，郭亞楠， 謝苗，和翔宇，劉雁峰*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；4.河南洛陽(yáng)66069部隊(duì)醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000 )

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是指有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位而引起的病證[1]。它的發(fā)病率逐年增高，是不孕、痛經(jīng)的重要原因，嚴(yán)重危害女性健康。在診斷為子宮內(nèi)膜異位癥的患者中，不孕的發(fā)生率約為30%～50%，而自然流產(chǎn)的發(fā)生率亦有約40%。痛經(jīng)的婦女中有40%～60%是此病所致[2]。這嚴(yán)重影響了育齡期女性的生活。目前GnRHa已成為治療EMs的一線藥物，但GnRHa引起的低雌激素癥狀如失眠、乏力、潮熱出汗、陰道干澀不適、關(guān)節(jié)痛、性欲下降、精神抑郁等類圍絕經(jīng)期癥狀及骨質(zhì)丟失限制了該藥物的長(zhǎng)期使用，因其帶來的明顯不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及治療依從性。本實(shí)驗(yàn)主要觀察研究滋水清肝理沖飲對(duì)EMs小鼠應(yīng)用GnRHa后體質(zhì)量和曠場(chǎng)行為的影響，探討滋水清肝理沖飲對(duì)EMs小鼠應(yīng)用GnRHa所致體質(zhì)量下降及活動(dòng)度降低的改善作用，從而為中醫(yī)藥干預(yù)治療EMs應(yīng)用GnRHa后的不良反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)6～8周齡雌性BALB/c小鼠78只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度控制20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，清潔度Ⅱ級(jí)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物分組

將BALB/c小鼠78只小鼠隨機(jī)分為捐贈(zèng)鼠20只，實(shí)驗(yàn)鼠58只，再將58只實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為正常組8只，疾病模型組、GnRHa組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組各10只。

1.3 試劑

補(bǔ)佳樂(戊酸雌二醇片)，0.9%氯化鈉溶液，水合氯醛，碘伏，蘇木素染液，伊紅染液，4%多聚甲醛。

1.4 藥物

滋水清肝理沖飲配方顆粒組成：由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，藥物組成：熟地黃15 g，山藥15 g，山茱萸10 g，牡丹皮6 g，茯苓10 g，丹參15 g，制鱉甲20 g，白芍12 g，炒梔子10 g，酸棗仁15 g，郁金10 g，合歡皮10 g，蓮子心3 g。

注射用醋酸亮丙瑞林緩釋微球，3.75 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20093809，生產(chǎn)廠家：北京博恩特藥業(yè)有限公司。

1.5 模型建立

小鼠造模前5天以補(bǔ)佳樂0.15 mg/kg灌胃，連續(xù)灌胃5 d；頸椎脫臼法處死供體小鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，碘伏消毒腹部皮膚，鋪巾，沿腹部正中線剖開腹腔，取出子宮，立即置入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中, 剔除子宮周圍的脂肪組織，漂洗干凈；沿Y型子宮正中線剪開，將子宮均分為左右兩半，分別放入含有1 mL生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將子宮縱行剖開，暴露出子宮內(nèi)膜面，然后剪碎呈約1 mm大小的小碎塊；消毒受體小鼠腹部后，于下腹部偏腹中線0.5 cm處的左下腹為進(jìn)針點(diǎn),將含有子宮內(nèi)膜碎片的1 mL生理鹽水混勻，用16號(hào)針頭注射器注入受體小鼠的腹腔；手術(shù)全程為無菌條件，全程操作控制在5 min內(nèi)完成；造模后連續(xù)以補(bǔ)佳樂0.15 mg/kg灌胃3 d。

1.6 子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠評(píng)價(jià)

造模后21天除外空白組，其余各組隨機(jī)挑選2只子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠開腹觀察異位病灶情況。5%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔麻醉，碘伏消毒腹部皮膚，鋪巾，沿腹部正中線剖開腹腔，逐層打開腹腔，觀察盆腹腔內(nèi)異位灶位置、形態(tài)、大小、數(shù)目、質(zhì)地和其與周圍組織的關(guān)系等情況。

1.7 給藥方法

除外正常組和疾病模型組外，其余各組在造模21 d后開始給予GnRHa皮下注射，共1次。在給予GnRHa皮下注射日當(dāng)天，中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組同時(shí)開始給予中藥灌胃(劑量分別為48 g/kg、24 g/kg、12 g/kg)連續(xù)給藥30 d；正常組、疾病模型組和GnRHa組給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)30 d。

1.8 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

在給藥結(jié)束后第一天進(jìn)行小鼠體質(zhì)量測(cè)定和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。比較各組間差異。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：制備小鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱(40 cm×40 cm×38 cm)，內(nèi)壁涂黑，底面平均劃分25個(gè)小格。選取安靜場(chǎng)地，將小鼠放入反應(yīng)箱中央，攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物在曠場(chǎng)內(nèi)5 min的行為學(xué)表現(xiàn)，記錄小鼠走出第一格的潛伏期、跨越方格總數(shù)和周邊時(shí)間(花在周邊12個(gè)方格總時(shí)間)、站立次數(shù)(雙腿離地)和大便顆粒數(shù)。兩只動(dòng)物之間用75%酒精擦拭底部及四壁，以免“前任者效應(yīng)”。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠評(píng)價(jià)

造模后第21天開腹觀察，經(jīng)大體觀察和組織病理學(xué)分析，造模成功率為100%。 異位病灶多位于小鼠左盆腹腔，還有異位于膀胱旁、腸系膜旁，成單個(gè)或多房葡萄樣，多呈透明樣，異位病灶表面和周圍可見細(xì)小血管(見圖1)。取異位病灶，石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色鏡下可見(見圖2)，異位病灶囊壁由上皮細(xì)胞層、間質(zhì)層、肌肉層和外周的漿膜層組成，可見腺體，內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈矮柱狀或立方狀，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

注：箭頭所指處為異位病灶圖1 異位病灶大體觀察

2.2 體質(zhì)量

用藥前后各實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量評(píng)分的比較

中藥治療前：治療前各組小鼠之間體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)。

中藥治療后：與正常組相比較，GnRHa組體質(zhì)量明顯減輕，琥珀散低、中劑量組體質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，琥珀散高劑量組與疾病模型組較正常組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與疾病模型組相比較，GnRHa組體質(zhì)量明顯減輕，琥珀散低、中劑量組體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，琥珀散高劑量組較疾病模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與GnRHa組相比較，琥珀散各劑量組體質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；琥珀散各劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

中藥治療前后同組間體質(zhì)量比較： 正常組與疾病模型組中藥治療前后體質(zhì)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GnRHa組中藥治療后較中藥治療前體質(zhì)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中藥各劑量組中藥治療后較中藥治療前體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠中藥治療前后體質(zhì)量評(píng)分比較

注：與正常組相比較，**P<0.01；與疾病模型組相比較，#P<0.05，##P<0.01；與GnRHa組相比較，△△P<0.01

2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分

2.3.1 各組小鼠潛伏期、跨越方格數(shù)、站立次數(shù)、周邊站立時(shí)間評(píng)分的比較

與正常組相比較：GnRHa組潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng),跨越方格數(shù)、站立次數(shù)、周邊站立時(shí)間明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；疾病模型組站立次數(shù)明顯減少,周邊站立時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；疾病模型組潛伏期及跨越方格數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；滋水清肝理沖飲各劑量組潛伏期、跨越方格數(shù)、站立次數(shù)和周邊站立時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

與疾病模型組相比較：GnRHa組潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，跨越方格數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，站立次數(shù)及周邊站立時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；滋水清肝理沖飲各劑量組周邊站立時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；潛伏期、跨越方格總數(shù)、站立次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠潛伏期、跨越方格數(shù)、站立次數(shù)、周邊站立時(shí)間評(píng)分比較

注：與正常組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與疾病模型組相比較，#P<0.05；與GnRHa組相比較，△△P<0.01

與GnRHa組相比較，滋水清肝理沖飲各劑量組潛伏期時(shí)間明顯縮短，跨越方格數(shù)及站立次數(shù)明顯增加，周邊時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥各劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3.2 各組小鼠大便顆粒數(shù)的比較

與正常組相比較：GnRHa組及疾病模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，滋水清肝理沖飲各劑量組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與疾病模型組相比較：GnRHa組大便顆粒數(shù)明顯增加，滋水清肝理沖飲各劑量組大便顆粒數(shù)減少，差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與GnRHa組相比較：滋水清肝理沖飲各劑量組大便顆粒數(shù)明顯較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；滋水清肝理沖飲各劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠大便顆粒數(shù)比較

注：與正常組相比較，**P<0.01；與疾病模型組相比較，##P<0.01；與GnRHa組相比較，△△P<0.01

3 討論

EMs是一種性激素依賴性疾病，大量研究表明，GnRHa的使用可使得性激素水平嚴(yán)重降低，成開花等[3]研究發(fā)現(xiàn)，使用GnRHa類藥物醋酸亮丙瑞林注射液進(jìn)行治療，在治療4周時(shí)，血清FSH、LH、E2、P水平明顯下降，12周較4周時(shí)無明顯變化，一直在絕經(jīng)期水平上下波動(dòng)，而停藥后2個(gè)月復(fù)查，上述激素均恢復(fù)至治療前水平。目前GnRHa已廣泛應(yīng)用于雌激素依賴性疾病如子宮內(nèi)膜異位癥手術(shù)前、手術(shù)后的補(bǔ)充治療，改善疾病相關(guān)癥狀并抑制子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)。但應(yīng)用GnRHa 所致的類圍絕經(jīng)期癥狀嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。Kim等[4]調(diào)查了GnRHa 治療EMs的不良反應(yīng)，主要是低雌激素證候群，表現(xiàn)為血管運(yùn)動(dòng)癥狀及骨質(zhì)流失。雌激素的降低可影響骨代謝，增加骨吸收速度，因此，低雌激素狀態(tài)容易引起骨質(zhì)疏松。1993年Leather等[5]提出“反向添加療法”，即在應(yīng)用GnRHa時(shí)，添加少量雌激素，可減輕單用GnRHa所引起的不良反應(yīng)。

研究人員在努力尋找性激素替代物中，發(fā)現(xiàn)植物雌激素可減輕圍絕經(jīng)期癥狀，又無雌激素的副作用。中藥的植物雌激素作用可作為性激素替代治療的新選擇。滋水清肝理沖飲為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院劉雁峰教授經(jīng)驗(yàn)方，該方在《醫(yī)宗己任編》滋水清肝飲的基礎(chǔ)上加減而成。滋水清肝飲為六味地黃丸合丹梔逍遙散化裁而來，現(xiàn)代研究認(rèn)為，六味地黃丸和丹梔逍遙散均具有植物雌激素作用。六味地黃丸具有抗去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的作用[6]，丹梔逍遙散則具有溫和的雌激素樣活性[7]，逍遙散中的3種成分槲皮素、山奈酚和異鼠李素促進(jìn)MCF-7的增殖，顯著增加ERα和ERβ蛋白和mRNA 的表達(dá)，這些作用均由ER介導(dǎo)[8]。滋水清肝理沖飲以熟地黃、山藥、山茱萸滋補(bǔ)肝腎之陰為君藥，將柴胡換成郁金、合歡皮與炒梔子共為臣藥，理氣清心除煩，并佐以丹參、牡丹皮養(yǎng)血活血，制鱉甲、蓮子心等滋陰清心共為佐使藥。該方源于古方又別于古方，合于古法又寓有新意，組方合理、配伍精妙，可通過滋補(bǔ)肝腎、清熱化瘀、解郁除煩以達(dá)到有效改善應(yīng)用GnRHa所致圍絕經(jīng)期癥狀。

本實(shí)驗(yàn)選擇體質(zhì)量、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等來探索各組小鼠的行為學(xué)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，小鼠進(jìn)入敞箱后，其對(duì)新異環(huán)境、噪聲的恐懼從而使得活動(dòng)次數(shù)減少，但動(dòng)物的探究特性又會(huì)促使其運(yùn)動(dòng)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)通過觀察小鼠在新異環(huán)境中的自主行為、探究行為與緊張度，從而反映出小鼠的焦慮水平[9]。通常情況下，曠場(chǎng)試驗(yàn)的水平活動(dòng)得分反映動(dòng)物的活動(dòng)水平，垂直活動(dòng)得分反映動(dòng)物對(duì)新鮮事物的好奇程度，即興趣的高低；其中跨格次數(shù)反映了動(dòng)物的活動(dòng)度,豎起次數(shù)反映了動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度,而焦慮動(dòng)物的跨格次數(shù)、豎起或修飾次數(shù)減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用GnRHa注射后的EMs小鼠即GnRHa組小鼠較疾病模型組小鼠體質(zhì)量減輕，活動(dòng)度降低，主要表現(xiàn)為潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、跨越方格數(shù)減少、大便顆粒數(shù)明顯增加，其探索行為減少。中藥滋水清肝理沖飲干預(yù)治療后與GnRHa組相比較，潛伏期時(shí)間明顯縮短，跨越方格數(shù)及站立次數(shù)明顯增加，周邊時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明顯改善GnRHa注射后EMs小鼠的體質(zhì)量減輕，活動(dòng)度降低，對(duì)新鮮事物的好奇程度降低。

綜上所述，我們通過腹腔注射法建立EMs小鼠模型的基礎(chǔ)上，給予GnRHa皮下注射，通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和體質(zhì)量的測(cè)定，證明中藥滋水清肝理沖飲在改善EMs小鼠應(yīng)用GnRHa后的質(zhì)量下降、活動(dòng)度降低、對(duì)新鮮事物的好奇程度降低等方面表現(xiàn)出較好的臨床優(yōu)勢(shì)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)研究動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)與探索行為的實(shí)驗(yàn)，可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)以及焦慮狀態(tài)[10],由此可推斷中藥滋水清肝理沖飲可能改善小鼠焦慮抑郁狀態(tài)，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探索研究。