辣木葉通便復方對小鼠通便作用的研究

張久旭，劉洋，李夢薇，顧文宏，龍興芬，趙保勝*

(1．北京中醫藥大學，北京 102488；2.云南天佑科技開發有限公司，云南 芒市 678400)

辣木為多年生速生樹，原產于印度，又稱為鼓槌樹，奇跡之樹，全世界約有14個品種[1]。辣木葉粉含有豐富的維生素、蛋白質以及氨基酸，其營養價值與現代營養學家稱為“人類營養的微型寶庫”的螺旋藻相當[2]，在食品領域得到了廣泛應用，近些年在醫學領域也越來越受歡迎，調查顯示，辣木葉粉有降血糖、降脂、降壓、改善睡眠等功效，長期食用可增強人體免疫功能，延緩衰老、預防疾病。在印度傳統醫學研究中，辣木葉性涼，具有通便、促進消化的作用[3]。賀銀鳳等人研究也表明了辣木葉具有明顯的通便作用[4]。

辣木復方葉由辣木葉、黃芪、白術組成，臨床應用具有較好的通便作用。本實驗在臨床研究基礎上，觀察辣木葉復方對便秘模型小鼠的通便作用，并觀察黃芪、白術與辣木葉的協同作用。

1 材料

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

辣木葉：由合作企業(云南天佑科技開發有限公司)提供；黃芪(批號：1611020，北京太洋樹康中藥飲片廠)；白術(批號：1609003，北京太洋樹康中藥飲片廠)；硫糖鋁(批號：11403077，北京虹湖聯合化工產品有限公司)；曙紅(批號：E100232，北京伊諾凱科技有限公司)；乙腈(色譜純，Fisher公司，批號：164790)；甲醇(分析純，北京化工廠，批號：20170209)；磷酸(分析純，北京化工廠，批號：20160111)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司，批號：201102GQ07547)；異槲皮苷(純度92.9%，111809-201403,中國食品藥品檢定研究院)；紫云英苷(純度99.5%，批號：Y27J7H9634,上海源葉生物科技有限公司)；蘆丁(純度98%，批號：170124，北京四面體生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗藥物的制備方法

實驗分組：辣木葉低劑量組(10 g/d)、辣木葉中劑量組(15 g/d)、辣木葉高劑量組(20 g/d)，黃芪白術組10g/d，復方組合①(辣木葉10 g/d+黃芪白術(10 g/d)、復方組合②(辣木葉15 g/d+黃芪白術10 g/d)、復方組合③(辣木葉20 g/d+黃芪白術10 g/d)

辣木葉干燥粉末：稱取辣木葉97.93 g于2 000 mL圓底燒瓶，加100 mL蒸餾水，浸泡2 h。回流提取2 h，保持微沸狀態，用紗布過濾，收集初濾液，再加入1 000 mL蒸餾水，回流提取2 h，合并2次的濾液，旋轉蒸發濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到辣木葉干燥粉末。

復方干燥粉末：以2倍處方量稱取各藥材，按不同的實驗分組分別進行水回流提取，紗布過濾，放置過夜，濾去沉淀，旋轉蒸發儀濃縮至一定體積，得濃縮液，60℃水浴濃縮至流浸膏，得到不同復方干燥粉末。

1.1.3 化學試劑及其配制

硫糖鋁混懸液配制：取硫糖鋁試劑0.2 g，取0.5 g羧甲基纖維素鈉，加入100 mL水，配制成質量濃度為2 mg/mL 的溶液。

曙紅溶液配制：取1 g曙紅，加入100 mL去離子水溶解，得到澄清、朱紅色的溶液。

1.1.4 實驗動物

ICR小鼠100只(由北京斯貝福生物科技有限公司提供，生產許可正號:SCXK(京)2016-0002)，SPF級，雌雄各半，體質量18～22 g。

1.1.5 儀器和設備

電子分析天平：Sartorius BSA2202S(濟南恒則成儀器有限公司)；旋轉蒸發儀：RE-52AA型(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋：XMTD-6000型(濟南溫騰醫療器械有限公司)；真空干燥箱：TAISITED 2-2BC型(上海索普機械有限公司)；紫外可見分光光度計(TU-1810，普析)；島津高效液相色譜儀(LC-16，日本島津公司)。

2 實驗方法

2.1 總黃酮含量的測定

2.1.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁14.94 mg，加入70%乙醇溶液超聲溶解，定容至100 mL容量瓶中。準確吸取蘆丁標準溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入25 mL刻度比色管中，加入30%乙醇至5 mL，后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，30%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后用1 cm比色皿在510 nm處測定吸光度。

以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得到蘆丁的線性回歸方程為y=0.001 3x-0.027 3，r2=0.999 9，蘆丁濃度在73.21～585.54 μg/mL范圍內，與吸光度呈良好的線性關系。如圖1所示。

圖1 蘆丁線性回歸方程

2.1.2 樣品總黃酮含量測定

根據實驗分組，各精密稱取0.25 g不同樣品干燥粉末，每個樣品平行稱取6份，加入25 mL 70%乙醇溶液，超聲30 min溶解，冷卻，補足稱重。準確吸取1 mL移入25 mL比色管中，按“2.1.1”項下測定吸光度。

2.1.3 精密度試驗

取1 mL供試品溶液至25 mL比色管中，按“2.1.1項下”操作，連續6次測定吸光度，RSD值為0.14%，表明儀器的精密度良好，可以滿足含量測定的要求。

2.1.4 穩定性試驗

分別取適宜濃度的對照品溶液和供試品溶液于0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h測量吸光度，RSD值分別為1.45%和1.47%，表明對照品和樣品在4 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗

精密稱取供試品約0.5 g，按照供試品的制備方法制備樣品6份，按照“2.1.1項下”測定吸光度，以吸光度計算RSD值為1.83%。說明本測定的方法的重現性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗

取裝量差異下的木葉通便復方②6份，各0.25 g，精密稱定，加入蘆丁適量，按照供試品制備方法制備樣品。測定吸光度，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD值。結果見表1。

表1 辣木葉通便復方回收率測定結果(n=6)

2.2 指標性成分的含量測定

2.2.1 對照品溶液制備

分別取異槲皮苷對照品10.00 mg、紫云英苷對照品10.60 mg置10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得異槲皮苷濃度為1.00 mg/mL和紫云英苷濃度1.06 mg/mL對照品儲備液溶液。分別吸取異槲皮苷對照品儲備液4.8 mL和紫云英苷對照品儲備液2.2 mL于10 mL容量瓶中定容至刻度作為混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

根據實驗分組分別取不同辣木葉通便復方樣品、辣木葉單味樣品、黃芪白術組樣品粉末各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，各精密加入50 mL甲醇，稱重。超聲(300 W,40 kHz)溶解30 min后取出，放冷，稱重，加入純甲醇補足重量，搖勻，靜置，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得各組供試品溶液。

2.2.3 色譜條件

色譜柱為Cosmosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脫，洗脫程序為：0～16 min 20%B,16～28 min 20%～50%B,18～22 min 50%B,22～23 min 50%～20%B,30 min 20%B；流速為1.3 mg/mL，柱溫為40℃，檢測波長為350 nm。進樣量為10 μL，上述色譜條件下，分析對照品和樣品。

2.3 通便實驗

2.3.1 實驗動物分組方法

取ICR小鼠90只，雌雄各半，體質量18～22 g，按體質量隨機分為模型對照組，辣木葉低劑量組(10 g/d)、辣木葉中劑量組(15 g/d)、辣木葉高劑量組(20 g/d)，黃芪白術組(10 g/d)，復方組合①(辣木葉10 g/d+黃芪白術(10 g/d)、復方組合②(辣木葉15 g/d+黃芪白術10 g/d)、復方組合③(辣木葉20 g/d+黃芪白術10 g/d)，每組10只小鼠。

2.3.2 小鼠便秘模型的建立

實驗前各組小鼠正常飲水， 除空白組外各組小鼠均灌以質量濃度為2 mg/mL 的硫糖鋁混懸溶液。 每天按 0.5 mL/只灌胃小鼠 1 次，連續 3 d ，第 4 天劑量減半，結果模型組小鼠出現首粒排便時間延長，4 h內排便粒數減少等表現。

2.3.3 辣木葉通便實驗

第4天分別給各組小鼠稱重，并記錄體質量。灌胃給藥硫糖鋁2 h后，按體質量給實驗組給藥。 陰性對照組和空白對照組每只小鼠灌以 0.5 mL蒸餾水, 灌制的液體中均混有曙紅溶液, 以便更好地觀測糞便顏色。各組小鼠單籠分養, 正常飲水、進食, 分別觀察記錄每只小鼠首次排出紅便時間和4 h內排便數量以及糞便干燥后的重量。

2.4 統計學方法

3 結果與分析

3.1 各樣品總黃酮含量測定結果

從總黃酮的含量測定結果來看，通便復方中的總黃酮主要來源于辣木葉，但經黃芪、白術配伍后，總黃酮含量明顯增多，并且以復方組合②增加的最明顯。各樣品總黃酮含量測定結果見表2。

3.2 各樣品指標性成分含量測定結果

從高效液相色譜法測定結果來看，按日服用生藥量計算，通便復方中選定的指標性成分異槲皮苷和紫云英苷的含量分別為61.699 mg,31.796 mg，辣木葉單味藥中異槲皮苷和紫云英苷的含量分別為40.386 mg,21.412 mg，復方中異槲皮苷和紫云英苷含量較辣木葉單味藥分別多21.313 mg,10.384 mg。各樣品指標性成分含量測定結果見表3。

表2 各樣品總黃酮含量測定結果(n=6)

表3 各樣品指標性成分含量測定結果(n=3)

3.3 小白鼠便秘模型的建立

除空白組外其它各組小白鼠灌胃硫糖鋁混懸液0.5 mL，有效成分濃度為2 mg/mL。空白對照組小鼠灌胃等量蒸餾水,觀測小白鼠排首便的時間。從表1可以看出,灌胃硫糖鋁的陰性對照組首次平均排便時間為104.80 min，灌胃蒸餾水的空白對照組首便平均時間為36.3 min，相差68.5 min，差異有統計學意義(P<0.001)。可以表明便秘模型成功建立[5-6]。

3.4 辣木葉及其復方對便秘模型小鼠首便時間的影響

在成功建立便秘模型的基礎上,對小鼠進行通便實驗研究,并設蒸餾水陰性對照組，結果見表4。由表中數據可以看出,通過陰性對照組與各實驗組的比較,多數實驗組首便時間明顯縮短，辣木葉及其復方與黃芪白術組對小鼠首便時間均有顯著有影響。實驗結果表明，三者均對小鼠的首次排便時間有作用，但復方2的作用效果明顯高于其他試驗組(P<0.001)。

3.5 辣木葉及其復方對便秘模型小鼠排便量的影響

測定各組小鼠在灌胃給藥后4 h內排便粒數和干糞便的重量,辣木葉及其復方對排便粒數及糞便干重影響顯著，但黃芪白術組對排便粒數及糞便干重影響不明顯。實驗結果表明，辣木葉及其復方灌胃給藥對便秘小白鼠的排便量均有顯著的影響。

表4 辣木葉及其復方灌胃給藥對小鼠通便作用的影響

注：與模型組比較，**P<0.01,*P<0.05

4 討論

便秘為大腸傳導功能失常所致，但與脾胃肝腎等臟腑的功能失調有關。目前隨著人們生活節奏的加快和飲食結構的改變，便秘患者日益增多，相當一部分便秘患者就診前曾受廣告影響、他人介紹而自行選擇瀉劑治療其便秘，這種沒有專業基礎作指導的用藥，常常發生不合理用藥的情況，引起一些原本可避免的副反應[7]。

目前對辣木葉通便作用的研究也有諸多報道，但對辣木葉復方通便作用的研究還未見報道，本次實驗以小鼠首便時間和4 h內糞便的粒數和干燥后的重量為指標，研究辣木葉及其復方灌胃給藥對小鼠通便作用的影響。結果顯示，辣木葉及其復方灌胃給藥對便秘小鼠具有明顯的通便作用，即明顯縮短小鼠首便時間并且增加了小鼠的排便重量，且辣木葉復方組②(辣木葉15 g/d+黃芪白術10 g/d)的整體通便作用更為明顯。

經過研究與查閱文獻可知，辣木葉主要含有黃酮類化合物[8-9]，本次實驗選擇了異槲皮苷和紫云英苷為指標性成分，二者均為黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、鎮痛等藥理作用[10-11]，有研究表明，具有抗氧化、抗炎作用的藥物和天然產物能夠保護腸黏膜的完整性，促進慢性傳輸型便秘腸道功能的恢復[12-13]。通便復方中的總黃酮主要來源于辣木葉，但經黃芪、白術配伍后，總黃酮含量明顯增多，并且此差值比黃芪、白術二味藥配伍后總黃酮值高出6倍，可能是由于辣木葉通便復方中黃芪含有大量皂苷類成分，有助溶性，可促進其他成分在水中的溶解度，配伍之后的黃酮含量明顯增加，并且復方中指標性成分含量也顯著增加，從而說明復方中各藥的化學成分在提取制備過程中，對其他成分產生助溶作用，可以在一定程度上表明復方配伍的優越性，同時也側面佐證了辣木葉通便復方的通便作用。總黃酮及異槲皮苷和紫云英苷的含量測定結果結合通便藥理實驗結果表明，辣木葉通便復方配伍較單味辣木葉、去辣木葉復方具有更高含量黃酮類成分，為其藥效提供了一定的化學物質基礎的數據支撐，為辣木葉復方的進一步深入研究奠定了一定的基礎。