黃芪甲苷含量測定研究進展

王繼明，陳麗娜，杜芳，韓國慶，王耀新

(內蒙古蒙肽生物工程有限公司研究院，內蒙古 呼和浩特 010051)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪干燥的根[1]。黃芪主要含有多糖、黃酮類化合物及三萜皂苷[2]，其中黃芪的主要活性成分為黃芪皂苷。黃芪甲苷為黃芪皂苷的主要成分，黃芪甲苷具有抗炎、抗肝纖維化、抗氧化、抗哮喘、降血糖、免疫調節和心肌保護等多重功效[3]。因此黃芪在醫藥和保健食品方面具有十分廣泛的應用。同時黃芪甲苷成為含有黃芪的醫藥和保健食品的質量控制指標之一?！吨袊幍洹?015年版[1]收錄了黃芪甲苷做為黃芪的質量控制指標。由于黃芪中含有多糖、黃酮、皂苷、氨基酸、色素等多種成分，為了使其他成分不對黃芪甲苷的含量測定產生影響，在對樣品中黃芪甲苷的含量測定前，需對樣品進行預處理。黃芪甲苷含量的測定方法有比色法、熒光法、薄層掃描法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和近紅外漫反射光譜法等，其中高效液相色譜法為近年來廣泛應用的方法。下面分別對樣品的預處理和黃芪甲苷含量測定的方法進行綜述。

1 樣品的預處理

圖1 黃芪甲苷含量測定預處理過程

樣品用甲醇提取，將樣品中的黃芪甲苷等成分溶解到甲醇中，用甲醇做為溶劑進行提取，常見的有回流提取和超聲提取2種方式。甲醇提取液脫除甲醇后用水溶解殘留固體，用乙醚或石油醚洗滌去除水溶液中的脂溶性雜質，用水飽和的正丁醇萃取，除去水溶液中的水溶性雜質，堿溶液洗滌去除酸性雜質，堿溶液一般為氨試液、1%氫氧化鈉或1%氫氧化鉀。用大孔吸附樹脂對樣品進一步純化，所用大孔吸附樹脂有D101型和DM-301型。對于大多數樣品的預處理均省略了乙醚或石油醚洗滌、大孔吸附樹脂處理步驟，黃芪甲苷含量的測定滿足方法學的要求。同時根據樣品的性質決定是否省略甲醇提取步驟。

圖1中省略乙醚或石油醚洗滌步驟，大孔吸附樹脂為D101型即為《中國藥典》2015年版[1]黃芪中黃芪甲苷含量測定的預處理方法。2013年丁如賢等人[4]報道了對黃芪供試品的處理中省去大孔吸附樹脂除雜步驟對黃芪甲苷峰的分離及檢測沒有任何影響。2011年劉浩文等人[5]比較了中國藥典和香港中藥材標準黃芪中黃芪甲苷含量測定方法。香港中藥材標準方法的重現性良好，結果準確可靠，且樣品前處理方法簡便，測得黃芪藥材中黃芪甲苷含量與中國藥典相比沒有統計學差異。香港中藥材標準黃芪中黃芪甲苷含量測定供試品溶液制備流程見圖2。

圖2 香港中藥材標準黃芪中黃芪甲苷含量測定供試品溶液制備流程

2006年朱蕾[6]報道了將保健食品用甲醇超聲提取、水飽和正丁醇萃取、1%氫氧化鉀洗滌、DM-301大孔吸附樹脂處理，所得的洗脫液又經過了Oasis HLB 3cc型固相萃取柱除去樣品中極性大于和小于黃芪甲苷的物質，并對其進行了富集，以達到儀器測定的靈敏度。

樣品預處理的目的是通過預處理步驟將樣品中的黃芪甲苷進行純化以滿足后續樣品測定的要求，根據樣品的性質，在滿足樣品測定需求的條件下，可以將樣品預處理過程簡化，節省樣品預處理時間，進而提高樣品檢測效率。

2 黃芪甲苷含量測定

2.1 比色法

比色法是通過黃芪甲苷與顯色劑發生顯色反應后生成有色物質，再用分光光度計測定吸光度，有色物質濃度與吸光度成正比，根據樣品的吸光度值計算樣品中黃芪甲苷的含量。2004年李永吉等人[7]利用香草醛-高氯酸比色法測定了復方黃芪注射液中總皂苷含量。復方黃芪注射液經水飽和正丁醇萃取、1%氫氧化鈉溶液洗滌、正丁醇飽和的水洗滌、溶劑脫除和甲醇溶解步驟得到供試品溶液。取供試品溶液脫除甲醇，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液和高氯酸，70℃水浴加熱20 min，冷卻后加入冰醋酸，于540 nm處測定吸光度。該方法的精密度、重現性和穩定性的RSD分別為1.5%、1.0%和0.34%。黃芪甲苷在8.33～41.67 μg/mL濃度范圍內線性良好(r=0.999 7)，回收率為100.64%。

2016年盧偉等人[8]將黃芪經甲醇回流提取、水飽和正丁醇萃取、氨試液洗滌、溶劑脫除和甲醇溶解步驟得到了供試品溶液。向供試品溶液中依次加入5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁溶液和4%氫氧化鈉溶液，每加一種溶液放置一段時間，然后在367 nm處測定吸光度。該方法的精密度、重現性和穩定性的RSD分別為1.9%、1.72%和1.81%，加標回收率為99.5%，黃芪甲苷在進樣量0～0.04 mg/mL范圍內線性較好(r=0.959 5)。

由于黃芪中含有多種三萜皂苷，黃芪甲苷為其中的一種，其他三萜皂苷也可能會與顯色劑發生相同的顯色反應，因此利用比色法可以測定總皂苷的含量，對于黃芪甲苷含量的測定較為困難。

2.2 熒光法

熒光法是利用黃芪甲苷與某些試劑反應生成在紫外光照射后能發射熒光的物質特性而定量分析的方法。2010年楊連梅等人[9]利用大茴香酸在硫酸介質中與黃芪甲苷反應產生強烈熒光的特性測定黃芪中黃芪甲苷含量，黃芪甲苷反應物最大激發波長為320 nm，最大發射波長為387 nm。該方法的精密度、重現性和穩定性的RSD分別為0.10%、1.41%和2.15%，加標回收率為97.22%，黃芪甲苷在1.0～8.0 μg/mL濃度范圍內線性良好(r=0.999 7)。

與比色法相同，熒光法適合于測定一類物質的含量，對于黃芪甲苷單組分含量的測定較為困難，需要通過繁瑣的預處理步驟以消除其他成分的影響。同時黃芪中三萜皂苷類物質的結構較為相似，分離難度較大。

2.3 薄層掃描法

薄層掃描法被2000年版《中國藥典》收載為黃芪中黃芪甲苷含量的測定方法。薄層掃描法的薄層板一般采用硅膠G，展開劑為氯仿-甲醇-水，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。2006年劉豐豐等人[10]用薄層掃描法測定了黃芪顆粒中黃芪甲苷含量。采用硅膠G薄層板，點狀點樣，展開劑為氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置過夜的下層液，展開晾干后，用10%硫酸乙醇溶液在105℃條件下加熱至斑點顯色清晰。用反射法雙波長鋸齒掃描，檢測波長和參比波長分別為530 nm和700 nm。該方法同板精密度和異板精密度的RSD分別為2.03%和2.31%，重復性的RSD為2.33%，加樣回收率為98.72%，黃芪甲苷在進樣量為1.012～8.096 μg范圍內線性良好(r=0.997)。2007年肖辛垣等人[11]報道了用薄層掃描法測定健兒涂膜劑中黃芪甲苷含量。采用硅膠G薄層板，展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶40∶22∶10)10℃以下放置12h的下層溶液，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，雙波長反射法鋸齒掃描，檢測波長和參比波長分別為530 nm和700 nm。該方法同板精密度和異板精密度的RSD分別為1.66%和2.80%，重復性的RSD為2.35%，穩定性的RSD為1.01%，加樣回收率為96.56%，黃芪甲苷在進樣量為0.5～2.5 μg范圍內線性良好(r=0.999 7)。2015年Jing Zhang等人[12]用高效薄層色譜同時測定了黃芪中的黃芪甲苷和芒柄花黃素。將黃芪干燥的根粉碎，置于索氏提取器中用石油醚脫脂，脫脂后將殘渣用甲醇回流提取，脫除甲醇，用水溶解殘渣，用水飽和的正丁醇提取，氨試液洗滌，將正丁醇相蒸發至干，用甲醇溶解得到供試品溶液。采用硅膠H薄層板，石油醚-水飽和正丁醇-冰乙酸(3.5∶2∶4)為展開劑，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液，在254 nm處掃描。進行了方法學驗證，具體情況見表1。

通過薄層色譜能夠將黃芪甲苷與其他成分進行分離，可以用于黃芪甲苷含量的測定，但是薄層掃描法測定過程需要進行樣品預處理、展開、顯色和掃描等步驟，處理過程較為繁瑣，樣品測定效率相對較低。

表1 HPTLC法測定黃芪中黃芪甲苷和芒柄花黃素方法學研究

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法具有分離度和靈敏度高及適用范圍廣等優點廣泛應用于黃芪甲苷的含量測定。在黃芪甲苷的含量測定中所用的檢測器有：紫外檢測器(UVD)、蒸發光散射檢測器(ELSD)、質譜檢測器(MSD)、電噴霧檢測器(CAD)和脈沖安培檢測器(PAD)。下面分別進行論述。

2.4.1 HPLC-UV法

黃芪甲苷的甲醇溶液最大紫外吸收波長為200.8 nm?？赏ㄟ^紫外檢測器進行測定，紫外檢測器是高效液相色譜中較為常用的檢測器。2014年，姜麗麗等人[13]用HPLC-UV法測定了黃芪干燥根中黃芪甲苷的含量。色譜柱為Kromail C18柱，流動相為乙腈-水(32∶68)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm。該方法精密度、穩定性和重復性的RSD分別為0.48%、2.87%和2.93%，回收率為98.22%，黃芪甲苷在0.05～0.50 mg/L濃度范圍內線性良好(r=0.999 7)。

由于黃芪甲苷的最大紫外吸收波長在200 nm左右，在此波長處許多雜質和溶劑有吸收，對黃芪甲苷的含量測定造成干擾。為了提高黃芪甲苷測定的靈敏度和專一性，將黃芪甲苷進行衍生化，向黃芪甲苷分子結構中引入共軛系統，使紫外吸收發生紅移。2000年Meicun Yao等人[14]開發了反相高效液相色譜測定黃芪甲苷含量的方法。采用了柱前衍生化方法，用苯甲酰氯與黃芪甲苷定量反應生成黃芪甲苷苯甲酰酯，色譜柱為Spherisorb ODS C18柱，流動相為90%甲醇-4%四氫呋喃-6%水-0.2%三乙胺，流速為0.8 mL/min，檢測波長為230 nm。用維生素D3做為內標物，對衍生化反應條件進行了優化，同時進行了方法學研究，黃芪甲苷在0.004～0.080 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，回收率為94.7%，檢測限為0.002 mg/mL。2006年朱蕾[6]也對黃芪甲苷的衍生化反應進行了研究，采用正交試驗設計對反應時間、反應溫度、吡啶用量和苯甲酰氯用量條件進行了優化，確定了最佳的衍生化反應條件。2012年侯素云等人[15]比較了HPLC-ELSD內標法(人參皂苷Rb2做為內標物)和柱前衍生化法(用苯甲酰氯進行衍生化)測定黃芪甲苷含量的優劣，實驗結果表明，柱前衍生化法測定結果的精密度、重復性、穩定性和準確度均優于HPLC-ELSD內標法。但是柱前衍生化法對樣品的預處理時間較長，樣品含量測定的周期較長。

2.4.2 HPLC-ELSD法

蒸發光散射檢測原理是流動相溶劑噴霧氣化，進入加熱管后溶劑揮發，留下被分析檢測的物質顆粒，被分析的物質顆粒經鐳射光產生散射，散射光由光電倍增管收集得到響應，光散射檢測器的響應大小由被分析物質顆粒的數量和大小決定，不受流動相溶劑的干擾，不要求被測組分有特定的化學結構。特別適合于黃芪甲苷這種紫外末端吸收，沒有特定吸收波長的情況，故被2015年版《中國藥典》[1]收載為黃芪中黃芪甲苷含量測定的方法。

2001年[16]Wenkui Li等人用HPLC-ELSD法測定了黃芪中黃芪甲苷含量，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18柱，用乙腈和水進行梯度洗脫，流速為1.6 mL/min，柱溫為20℃，蒸發溫度為43℃，氣體壓力為3.4 bar。黃芪甲苷的檢測限為40 ng，平均回收率為95.8%。該方法為測定黃芪甲苷含量的主要方法。表2中列出了2015—2017年用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量的相關研究。

與紫外檢測器相比，蒸發光散射檢測器不需要進行衍生化反應，適用于沒有紫外吸收的物質。縮短了樣品的測定周期。

2.4.3 HPLC-MS法

質譜分析具有靈敏度高、選擇性強、準確性好等特點。高效液相色譜與質譜聯用可以分析復雜成分樣品和微量物質，為復雜樣品中黃芪甲苷的含量測定提供了方法。2017年李光河[29]用液相色譜-質譜法測定了丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷含量，色譜柱為Agilent SB-C18柱，流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(70∶30)，流速為0.4 mL/min，柱溫為30℃。質譜條件為：電噴霧正離子模式檢測，黃芪甲苷選擇離子對為627.4-807.2，霧化器壓力為35 psi，干燥氣流速為8.0 L/min，干燥氣溫度為450℃，毛細管電壓為4 000 V，四級桿溫度為100℃。研究結果表明，該方法精密度、重復性和穩定性(8 h)的RSD分別為2.7%、2.0%和2.8%，加樣回收率為99.42%，黃芪甲苷在5.1～76.5 ng/mL濃度范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 4)。

2.4.4 HPLC-CAD法

蒸發光散射檢測器和電噴霧檢測器都屬于氣溶膠型檢測器，電噴霧檢測器是在2004年推出的一種較為新型的通用檢測器，其響應值不依賴于被測物質的光學性質和離子化效率，能檢測非揮發或半揮發性物質。與蒸發光散射檢測器相比，電噴霧檢測器的檢出限更低，靈敏度更高。2012年劉興國等人[30]比較了質量型檢測器ELSD和CAD用于測定黃芪甲苷的優劣。ELSD和CAD都能夠準確可靠地進行黃芪甲苷含量的測定，但是CAD的檢出限和定量限要比ELSD低得多。CAD在靈敏度和重現性方面均要好于ELSD。2014年李效寬等人[31]利用在線固相萃取法結合電噴霧式檢測器測定了黃芪甲苷的含量。用Acclaim PA2凈化柱對樣品純化。樣品分析柱為Acclaim C18，乙腈-水(35:65)為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃。電噴霧檢測器的霧化溫度為30℃，氮氣壓力為241.3 kPa。黃芪甲苷的定量限為0.66 mg/L，檢出限為0.33 mg/L。黃芪甲苷在4.0～80 mg/L濃度范圍內線性關系良好(r=0.999 8)。2016年梁慧敏等人[32]用高效液相色譜-電噴霧檢測器法測定了貞芪扶正顆粒中黃芪甲苷含量。色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱，乙腈-水(32∶68)為流動相，流速為1.0 mL/min。電噴霧檢測器霧化溫度為35℃，載氣氮氣壓力為63.6 psi。該方法精密度、重復性和穩定性的RSD分別為1.1%、1.5%和1.1%。加樣回收率為99.14%，黃芪甲苷在進樣量為0.286～2.86 μg范圍內線性良好(r=0.999 8)。

表2 HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量文獻匯總(2015—2017年)

2.4.5 HPLC-PAD法

脈沖安培檢測器出現在20世紀80年代初，是美國Dionex公司為滿足糖的測定而研制[33]。在較高pH溶液中，糖可在金電極上被氧化，因此可用電化學法進行檢測。由于金電極吸附待測成分的氧化產物以及金電極表面形成氧化層，使得金電極會很快失效。為了解決這一問題，由三個不同的脈沖電位代替加于工作電極上的恒定電位。用較工作電位高的正電位除去金電極上被測成分的氧化產物。同時再加一個大的負電位，使金電極部分被氧化成的氧化金還原到還原狀態。黃芪甲苷中含有糖的部分，因此可用脈沖安培檢測器進行黃芪甲苷的檢測。2012年Ha-Jeong Kwon等人[34]用HPLC-PAD法測定了黃芪中的黃芪皂苷含量。脈沖安培檢測系統包括金工作電極和Ag/AgCl參比電極。電位波形為：E1=-0.2 V(0.00-0.004 s)，E2=0 V(0.05-0.21 s)，E3=+0.22 V(0.22-0.46 s)，E4=0 V(0.47-0.56 s)，E5=-2V(0.57-0.58 s)，E6=+0.6V(0.59 s)。以洋地黃毒苷做為內標物，以黃芪甲苷與內標物峰面積比和黃芪甲苷濃度進行線性回歸，線性范圍為0.000 6～0.4 μg,r2=1.000 0。黃芪甲苷的檢測限和定量限分別為0.2 ng和0.6 ng。黃芪甲苷加入量為0.10 mg，回收率為(91.33±3.69)%，黃芪甲苷加入量為1.00 mg，回收率為(96.19±1.68)%。

2.5 超高效液相色譜法

與高效液相色譜相比，超高效液相色譜法的檢測速度較快，靈敏度和分離度較高。2015年Li Wang等人[35]使用超高效液相色譜-四極軌道阱質譜測定了保健酒中黃芪甲苷含量。色譜柱為Hypersil GOLD C18，用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，柱溫為35℃。Q Exactive MS系統由四極質譜和軌道阱質譜組成。電噴霧正離子模式檢測，檢測m/z807.45→m/z627.39離子躍遷，離子源電壓為3200 V，溫度為350℃。黃芪甲苷的定量限和檢測限分別為0.5和0.25 ng/mL，回收率為92.5%～96.7%，線性范圍為1.8～36 ng/mL，回歸系數為0.999 9。超高效液相色譜-四極軌道阱質譜具有分析速度快、高的靈敏度和選擇性的優點。2016年華云鵬等人[36]用UPLC-MS法測定了安喘舒丸中的黃芪甲苷含量。色譜柱為Agilent ZOBAX SB C18色譜柱，甲醇-0.1%甲酸水溶液(25∶75)為流動相，流速為0.2 mL/min，柱溫為35℃。電噴霧正離子模式檢測，毛細管電壓為4 000 V，干燥氣溫度為400℃，檢測對象為m/z808.2→m/z628.5。黃芪甲苷的定量限為5 ng/mL，精密度、穩定性和重復性的RSD分別為2.7%、2.4%和3.4%，加樣回收率為97.20%。

2.6 其他方法

2012年Li Gu等人[37]報道了使用茜素紅做為電流指示器，基于硼酸功能化的多壁碳納米管的新型電化學傳感器用于黃芪甲苷含量的測定。2017年戰皓等人[38]采用近紅外漫反射光譜法對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量進行了測定。

3 結語

黃芪甲苷做為黃芪類藥物和保健食品的標志性成分，其含量的測定方法主要有比色法、熒光法、薄層掃描法和液相色譜法等。比色法和熒光法的操作簡單、成本低廉，可用于黃芪總皂苷含量的測定。薄層掃描法設備簡單，操作方便，但預處理復雜，在早期的黃芪甲苷含量測定應用較多。高效液相色譜法中使用的檢測器有：紫外檢測器(UVD)、蒸發光散射檢測器(ELSD)、質譜檢測器(MSD)、電噴霧檢測器(CAD)、脈沖安培檢測器(PAD)。使用紫外檢測器直接測定干擾較為嚴重，將樣品進行衍生化處理后可用紫外檢測器進行檢測，但樣品的前處理復雜，測定樣品所需時間較長。蒸發光散射檢測器具有靈敏度高、受干擾因素少等特點，目前黃芪甲苷含量的測定多用該檢測器。電噴霧檢測器在靈敏度和重現性方面均要好于ELSD，是今后推廣應用的方向。質譜檢測器和脈沖安培檢測器更適合于黃芪甲苷的微量分析。超高效液相色譜與質譜聯用技術也用于黃芪甲苷的含量測定，該方法與高效液相色譜相比，具有檢測速度較快，靈敏度和分離度高等特點，是今后黃芪甲苷含量測定的發展方向。