不同功能基團對氧化石墨烯生物相容性影響的研究*

王麗麗，黃慶利

(1. 徐州醫科大學臨床醫學系，徐州 221004；2. 徐州醫科大學基礎醫學院，徐州 221004)

1 引 言

石墨烯(graphene)作為一種sp2雜化的新型二維碳納米材料[1-2]，由于其獨特的物理和化學性質，原料易得，價格低廉，被普遍應用于生物傳感器、化學儲能、環境保護等眾多領域[2-3]。石墨烯的氧化產物氧化石墨烯(graphene oxide，GO)，相比之下具有較高的比表面積，豐富的含氧活性官能團(如-OH，-COOH)等特點，近年來越來越多的被作為基因和抗癌藥物載體[4-9]。然而，氧化石墨烯存在動物和細胞毒性、在生理溶液中易聚集難分散等不足[2,6]，很多課題組已對其進行表面修飾以改善石墨烯復合材料的生物相容性及控制其體內循環運行[7，10-11]。

本研究分別以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)、氨基-β-環糊精(β-CDs)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為修飾劑[12-13]，通過水熱法[14-15]合成了3種不同修飾分子的石墨烯材料。然后通過透射電子顯微鏡(TEM)、紅外光譜(FIIR)、表面電勢(Zeta)等手段對其結構和功能進行表征，并且通過 CCK-8 實驗對其體外細胞相容性進行了探究。試驗結果表明，不同功能基團修飾的石墨烯材料對Hela細胞和MDA-MB-231細胞具有不同的生物相容性。其中GO-APS生物相容性較差，GO-BSA生物相容性最好，該研究為后續進一步功能化修飾及其成為理想的藥物載體打下基礎。

2 實驗部分

2.1 實驗材料與儀器

2.1.1實驗材料與試劑 石墨烯分散液(2 mg/mL，南京先豐納米科技有限公司)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；全氨基-脫氧β-環糊精(β-CDs，山東濱州智源生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，BIOSHARP生物公司)；DMEM培養基(江蘇凱基生物技術股份公司)；PBS緩沖液(江蘇凱基生物技術股份公司)；胰酶細胞消化液(微科曼得生物工程有限公司)；CCK-8試劑盒(微科曼得生物工程有限公司)。

2.1.2實驗儀器 JA2003N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；磁力攪拌器(江蘇天由有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；Zeta電位儀(美國PSS公司)；三氣培養箱(香港力康生物醫療科技控股有限公司)；生物安全柜(香港力康生物醫療科技控股有限公司)；臺式低速離心機(德國艾本德股份有限公司)；多功能微孔板檢測儀(基因有限公司)。

2.1.3細胞系 MDA-MB-231乳腺癌細胞、Hela細胞，培養于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素和90% DMEM培養基中，放置在37 ℃，CO2濃度為 5%的細胞培養箱中，1～2 d更換培養基。

2.2 功能化氧化石墨烯材料GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的制備

取15 mL 2 g/L GO水溶液加入30 mL去離子水，超聲0.5～1 h使其分散至均勻。隨后取標號為①②③的三個反應釜，分別向每個釜加入15 mL GO分散液。在磁力攪拌下，分別向①號釜加入0.2 mL APS，向②號釜加入50 mg β-CD，向③號釜加入100 mg BSA,常溫下攪拌30 min，進行活化反應。接著，將裝有反應液的反應釜放入電熱鼓風干燥箱中反應，100℃，反應6 h后停止，使其自然冷卻至室溫。

產物用超純水和乙醇分別離心洗滌3次，加超純水稀釋，配制得到濃度均為400 μg/mL的三種改性氧化石墨烯復合材料，4℃放置備用。

2.3 材料的表征與測試

2.3.1透射電子顯微鏡(TEM)測試 將樣本GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA配置成低濃度溶液，分別滴在銅網上，自然晾干后，用透射電子顯微鏡對其進行拍攝，以觀察修飾前后氧化石墨烯的整體形貌變化。

2.3.2電勢分析(Zeta)測試 將GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA固體利用NaBr壓片，利用紅外光譜儀進行測試。

2.4 材料的體外細胞毒性實驗

(1)將培養良好的Hela細胞和MDA-MB-231細胞(3～5×105個)經過消化并離心處理后，加入含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的新鮮DMEM培養液中。按每孔100 μL(5～8×103的細胞密度)細胞懸液將其分散在96孔板中(最外圍一圈孔板不使用)，隨后放入培養箱中培養24 h。

(2)待細胞貼壁生長后，吸掉原培養液，用PBS清洗3次后，接著每孔加入100 μL含不同濃度的GO，GO-APS，GO-CDs和GO-BSA的新鮮培養液。這四種材料均有4個不同濃度，分別為20、40、80和160 μg/mL，每種材料和細胞繼續培養相同時間，均為24 h。

(3)吸掉原培養液，用PBS清洗3次后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液和90 μL DMEM培養液，每種材料和細胞繼續培養相同時間，均為1 h。用酶標儀檢測各個孔在450 nm處吸光值(A)。

(4)實驗均以不加任何材料處理的細胞作對照組，每組數據來自5個平行樣本。

細胞存活率=(OD實驗組- OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%

OD實驗組為材料處理細胞后，在96孔板中利用酶標儀上所得吸光值， OD空白為未加細胞，只有培養液和CCK溶液的吸光值(修飾后的GO對450 nm處吸光值無影響)，OD對照組為不加任何材料、只有細胞和培養液的吸光值。且OD值均用均數±標準差表示。

2.5 統計學處理

本實驗結果使用SPSS 20．0統計軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA)，以P<0.05表示差異有統計學意義。用Origin 8.5軟件作圖。

3 結果和討論

3.1 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的透射電鏡結果

不同修飾分子修飾的GO形貌上會發生一定變化。為了研究3種修飾分子在GO表面的修飾情況，我們利用透射電子顯微鏡對樣品進行了表征[16]。圖1是未修飾的GO和不同分子修飾的GO的透射電子顯微鏡照片，從圖1A中我們發現，未修飾的GO為透明的薄片狀結構，有明顯褶皺存在。當APS修飾后，其整體結構不變，但透明度略有降低，這主要是APS分子量較小導致其表面變化不明顯，見圖1B。BSA修飾后，見圖1C,GO明顯變得基本不透明，有一層糊狀物質覆蓋在GO表面，這主要是BSA作為蛋白其可以通過靜電吸附等作用結合在GO表面。而當環糊精CD修飾后，由于我們所用環糊精表面含有氨基使其能夠連接到GO表面，見圖1D，在GO表面我們也發現CD覆蓋。

A.氧化石墨烯；B.乙氧基硅烷修飾氧化石墨烯；C.牛血清蛋白修飾氧化石墨烯；D.環糊精修飾氧化石墨烯

圖1GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA透射電鏡圖

Fig1TransmissionelectronmicrographsofGOandGO-APS,GO-CDsandGO-BSA

3.2 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的紅外光譜結果

紅外光譜可以用來檢測材料微觀結構的變化及存在的界面相互作用[16]。GO、 GO-APS、GO-CDs和 GO-BSA的紅外光譜見圖2。圖中1633 cm-1和1380 cm-1處為芳基羧酸中-COOH的特征吸收峰。當APS修飾后，其峰位位移到1508 cm-1和1269 cm-1處，主要是APS修飾后，GO化學環境發生改變從而導致其特征峰位移。同樣的道理，當CD和BSA修飾后，其峰位置也明顯發生改變，說明CD和BSA成功修飾[17]，這與前面透射電子顯微鏡的結果相一致。

圖2 GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA紅外光譜圖

3.3 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的Zeta電位結果

為了進一步研究各種修飾劑的修飾情況，我們通過Zeta電位儀測試各個樣品的Zeta電位，見圖3。結果表明GO的Zeta電位為負值。但當修飾了環糊精后其電位變成了正值，而修飾APS和BSA后，其Zeta電位為負值，雖然依然為負值，但其數值明顯較純GO的Zeta電位更低，這和這些修飾分子本身的特性有關。通過Zeta電位研究，進一步證明了3種分子成功修飾到了GO表面，我們可以根據后續工作的需要選擇不同的修飾分子。

圖3 GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的Zeta電位圖

3.4 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的體外細胞相容性

生物安全性是納米材料作為藥物載體的重要條件之一，因此我們對合成材料GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA進行體外細胞毒性檢測，CCK-8結果見圖4。從圖中大體走向趨勢可以看出，細胞毒性具有一定的濃度依賴性[18-22]，隨著四種材料液濃度的增加，細胞的存活率都有一定程度的下降，細胞毒性增加，而且結果均為GO-BSA細胞毒性< GO-CDs細胞毒性< GO-APS細胞毒性。

根據細胞毒性分級指標劃歸，在MDA-MB-231細胞的試驗(圖4a)中，GO不但對細胞無毒性作用，甚至有微弱促進細胞生長的效果；GO-APS在濃度達40 μg/mL時，已經具有微弱的細胞毒性；GO-CDs在濃度達80 ug/mL時，具有輕微的細胞毒性；然而GO-BSA即使在最高濃度 160 μg /mL 條件下，仍無明顯的細胞毒性，存活率在85%以上。在Hela細胞的試驗(圖4b)中，APS修飾的GO甚至比GO具有更高的細胞抑制率，β-CD和BSA修飾后的GO，細胞毒性有明顯減小。各組差異均有統計學意義(P<0.05)。綜上所述，納米石墨烯的細胞毒性和細胞種類有一定關系[20-22]， GO-APS即使在低濃度(20 μg /mL)對Hela細胞都有明顯毒性，而GO-CDs和GO-BSA在100 μg /mL以內，基本對兩種細胞均無毒性。因此，GO-CDs和GO-BSA可以作為藥物載體的優先選擇。

圖4 GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的細胞相容性結果

Fig4CellularcompatibilityresultsofGOandGO-APS,GO-CDs,andGO-BSA

4 結論

我們首先采用水熱法一步合成了官能化修飾的氧化石墨復合納米材料。通過透射電子顯微鏡、紅外光譜和zeta電位表征，這些分子被成功修飾到GO表面。同時我們還研究了這些修飾后的GO的細胞相容性，結果發現不同修飾材料具有不同的生物相容性。其中CD和BSA修飾的GO基本無生物毒性。這將為進一步拓寬石墨烯功能化復合納米材在醫藥領域的應用奠定了一定基礎。