膠原海綿促進人絨毛膜來源間充質干細胞向血管內皮細胞分化的研究

苗宗寧，孫鴻麗，薛一峰△

(1.無錫市第三人民醫院研究所，無錫 214041；2.南京醫科大學附屬無錫人民醫院，無錫 214023)

1 引 言

組織工程技術在臨床研究中顯示出誘人的前景和巨大的潛能，而體外構建的組織工程組織血管化研究仍然是亟待解決的關鍵問題，血管內皮細胞是此問題的核心。血管內皮細胞是一種終末分化的細胞，體外大量增殖相對困難，因此影響了臨床上的廣泛應用[1]。尋找一種具有內皮細胞特性，且能大量繁殖的種子細胞就成為組織工程研究的熱點之一。利用干細胞具有自我更新和多向分化潛能的特性，在體外定向誘導分化成血管內皮(前體)細胞是全新思路。2004 年Oswald 等[2]首次在體外用VEGF 誘導骨髓間充質干細胞向血管內皮細胞分化，誘導后的細胞具備血管內皮細胞的某些特征。VEGF又稱促血管因子，能特異性促內皮細胞遷移、增殖及形成管腔樣結構的重要刺激因子。而 bFGF對VEGF 具有非特異性促增殖作用，與VEGF 產生協同效應，能夠促進MSCs 分化為內皮細胞和形成小管樣結構[3]。有學者用包含VEGF、bFGF等的EBM-2培養基誘導MSCs向血管內皮細胞分化，結果發現誘導后的細胞表達血管內皮細胞的特異性標志，血小板內皮細胞黏附分子-1(CD31)和vWF因子，在體外可形成毛細血管樣的結構，具有與人血管內皮細胞一樣的表型和功能特征[4]。本研究通過觀察人絨毛膜來源間充質干細胞(chorionic membrane mesenchymal stem cells，CMSCs)在膠原蛋白海綿中的表型以及向血管內皮細胞分化潛能，明確膠原海綿對CMSCs細胞的生物相容性，評價CMSCs和膠原海綿在組織工程血管化研究中的應用前景。

2 材料與方法

2.1 組織標本來源

經醫院倫理委員會批準，在產婦知情同意的情況下，獲取正常健康孕婦剖宮產的新鮮胎盤組織，無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病，無遺傳性疾病史，大小及重量在正常范圍內。

2.2 實驗試劑與儀器

DMEM-LG，Newborn Calf Serum，Penicillin-Streptomycin-Neomycin，胰蛋白酶(Gibco)； Anti-CD31，Anti-vWF(Abcam)； IV型膠原酶，DAPI(Sigma)；Recombinant human VEGF，bFGF(Peprotech)；Matrigel? Basement Membrane Matrix(BD)；膠原海綿(無錫貝迪生物有限公司)。

2.3 方法

2.3.1hCMSCs分離培養鑒定 參照項目組前期文獻[5-6]，無菌條件下機械分離胎盤絨毛膜組織，用預冷的D-Hank’s緩沖液反復沖洗去除血細胞，用眼科剪將絨毛膜組織盡可能剪成細碎小塊，0.1%IV型膠原酶，37℃水浴消化15 min，200目細胞篩網過濾， 1500 rpm離心10 min，收集沉淀細胞，調整濃度為1×106/mL接種于25 cm2的培養瓶。培養基包括DMEM-LG、1%Penicillin-Streptomycin、10% FBS、10 ng/mL bFGF。37℃、5%CO2，飽和濕度靜置培養。細胞密度達到80%，融合后用0.25%胰蛋白酶消化，1瓶分2瓶的比例傳代培養。

2.3.2hCMSCs向血管內皮細胞分化及鑒定 0.25%的胰蛋白酶消化后，收集培養第二代hCMSCs，調整細胞濃度至1×105/ mL接種于6孔板，生長密度達到50%時，用D-Hank’s緩沖液洗2遍，實驗組加入條件培養基(基礎培養基+50 ng/mL VEGF)誘導培養，每2 d 換液，顯微鏡下觀察細胞形態；對照組繼續用基礎培養基培養。連續誘導培養14 d 后，實驗組和對照組細胞進行CD31和vWF免疫熒光染色，并計算陽性細胞比例。

2.3.3Matrigel成管實驗 將Matrigel基底膜基質置于4℃冰水浴中融化，按30 μL/well鋪于96孔板，在 37℃培養箱放置 1 h后，實驗組收集誘導分化的細胞按5×103/well的密度接種于96孔板，置于37℃、5%CO2，飽和濕度靜置培養，2 h后，開始在倒置顯微鏡下觀察細胞形成管狀結構的形態，對照組接種相同數量的hCMSCs，24 h后通過CD31、vWF單克隆抗體免疫熒光染色觀察實驗組和對照組毛細血管樣結構的形態。

2.3.4hCMSCs與膠原海綿復合培養并向血管內皮細胞誘導分化 無菌條件下將膠原海綿制成5 mm×5 mm×2 mm大小，用PBS緩沖液濕潤1 h，再用含體積分數為10%的胎牛血清的DMEM浸泡1 h。收集培養的第三代hCMSCs，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL；取24孔培養板，將裁剪好的膠原海綿置于孔內，滴加100 μL細胞懸液；將培養板置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中孵育1 h；取出，將膠原海綿翻轉，滴加100 μL細胞懸液，37℃繼續孵育1 h，實驗組取出后，加入800 μL條件培養基(基礎培養基+50 ng/mL VEGF)，對照組應用基礎培養基培養，誘導培養14 d，每2 d 更換培養基。

2.3.5組織學檢測 將培養2周的hCMSCs與膠原海綿復合物(實驗組和對照組)經石蠟包埋后切片，厚度5 μm，行HE染色和CD31、vWF免疫熒光染色分析。

2.3.6統計學分析 采用SPSS13.0軟件完成統計處理，組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學顯著性。

3 結果

3.1 hCMSCs分離培養及生物學特性

胎盤絨毛膜組織經膠原酶消化后收集的細胞靜置培養3 d，可見少量粗短的梭形或多角形的貼壁細胞，培養2周后才能達到 80%的融合。用胰蛋白酶消化傳代后，細胞生長速度明顯加快，接種第5 d即可達到90%融合，細胞形態呈相對均勻一致的長梭形，旋渦狀生長。流式細胞儀檢測結果顯示hCMSCs表達CD73、CD90和CD105，不表達CD34和HLA-DR[5]。

3.2 hCMSCs向血管內皮細胞分化

hCMSCs經條件培養基向血管內皮細胞誘導培養后，細胞形態發生改變，細胞趨于圓形，鋪路石樣排列。免疫熒光染色結果顯示，誘導后的細胞表達CD31和vWF，見圖1。實驗組CD31陽性細胞比例42.5±2.6%，vWF陽性細胞比例25.4±1.8%，對照組沒有陽性細胞表達，組間比較，P<0.01，具有顯著性差異。

圖1hCMSCs向血管內皮細胞分化前后形態變化。左圖，A為未誘導對照組，免疫熒光染色只能觀察到藍色的細胞核×40；右圖，B為誘導實驗組，誘導14d后，CD31和vWF免疫熒光染色可見綠色陽性表達×100。

Fig1ThemorphologicalchangesofhCMSCsbeforeandafterthedifferentiationofvascularendothelialcells.Left,theimmunofluorescencestainingcanonlyobservethebluenucleusofthenucleuswithincontrolgroup(A) ×40.Right,CD31andvWFimmunofluorescencestainingshowgreenpositiveexpressionwithinexperimentalgroup(B)after14daysinduced×100.

3.3 hCMSCs血管形成實驗

實驗組hCMSCs接種于Matrigel基質膠后，顯微鏡動態觀察表明，2 h后細胞即可貼壁、黏附，6 h后細胞逐漸集聚成團狀并向四周發散生長，逐步形成分散的網狀結構，周圍聚集單層細胞，并且細胞數量逐漸增多，12 h后網狀結構相互連接，形成管狀結構，免疫熒光染色可見形成管狀結構的細胞CD31和vWF陽性表達，見圖2左。對照組hCMSCs接種于Matrigel基質膠后，顯微鏡動態觀察表明，2 h后細胞即可貼壁、黏附，細胞不集聚成團狀也不形成分散的網狀結構繼而形成管狀結構，CD31和vWF免疫熒光染色未見細胞陽性表達，見圖2右。

圖2左圖，實驗組hCMSCs在Matrigel基質膠上血管形成實驗12h后形態，培養24h后CD31和vWF免疫熒光染色陽性，箭頭指示管狀結構，Bar=200μm。右圖，對照組hCMSCs在Matrigel基質膠上血管形成實驗12h后形態，未見管狀結構，培養24h后CD31和vWF免疫熒光染色陰性，Bar=100μm。

Fig2Inexperimentalgroup(left),hCMSCsformed12hontheMatrigelmatrix,andtheCD31andvWFimmunofluorescencestainingispositiveaftertheco-culturedof24h.Thearrowindicatesthetubularstructure,Bar=200μm.ThecontrolgrouphCMSCsontheMatrigelmatrixisformedafter12h,andnotubularstructureisfound(right).Afterco-culturedof24h,CD31andvWFimmunofluorescencestainingisnegative,andBar=100μm.

3.4 hCMSCs與膠原海綿復合培養后H-E染色

實驗組hCMSCs與膠原海綿復合培養2周后取材切片，H-E染色可見膠原海綿的多孔結構非常有利于細胞長入，部分細胞沿膠原支架密集生長，細胞形態不一，大部分呈棱形和多角形，細胞核染淡藍色，呈橢圓形，胞質染淡紅色。細胞與細胞之間相互交連。免疫熒光染色結果可見細胞散在分布，CD31和 vWF陽性表達。對照組同樣有細胞生長，免疫熒光染色未見CD31和 vWF陽性表達。由于切片取材的因素，有些陽性表達區域未見細胞核，間接表明細胞沿著材料生長，分布沒有規律，見圖3。

4 討論

間充質干細胞是來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新、免疫原性低的特點，可分化成為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等中胚層的組織細胞，在組織工程研究以及細胞治療方面有著廣泛的應用[7]。本研究從人胎盤絨毛膜分離培養間充質干細胞，在一定誘導條件下，通過包含VEGF、bFGF的DMEM培養基，誘導hCMSCs向血管內皮細胞分化，免疫熒光染色結果顯示，誘導后的細胞表達內皮細胞表面標記物CD31和vWF因子，證實hCMSCs具有向血管內皮細胞分化的潛能。

圖3左圖，實驗組，hCMSCs與膠原海綿復合培養2周，HE染色結果×100，CD31和vWF免疫熒光染色結果陽性，Bar=20μm。右圖，對照組，hCMSCs與膠原海綿復合培養2周，HE染色結果×100，CD31和vWF免疫熒光染色結果陰性，Bar=20μm。

Fig3Intheexperimentalgroup(left),HEstainingresultsofhCMSCsandcollagenspongeco-culturedfor2weeks, ×100.CD31andvWFimmunofluorescencestainingresultsarepositive,Bar=20μm.Inthecontrolgroup(right),HEstainingresultsofhCMSCsandcollagenspongeco-culturedfor2weeks, ×100.CD31andvWFimmunofluorescencestainingresultsarenegative,Bar=20μm.

構建組織工程研究的生物支架材料，主要是有利于種子細胞粘附、增殖以及分化等，研究表明大孔徑支架比小孔徑支架更有利于細胞生長及血管化，但其機械強度會隨之降低[8]。本研究所選的膠原海綿孔徑在50～100 μm，在和細胞復合培養后的第1 d，即有細胞通過基質與材料相連，第8 d細胞大量增殖，這都說明膠原海綿與細胞間有良好親和性，適合細胞的大量增殖，這與Glowacki等認為在三維支架材料培養細胞有利于提高細胞增殖能力的結論相似[9]。同時本研究結果表明，hCMSCs在膠原海綿三維支架上誘導培養14 d后，細胞表達CD31和vWF，表明hCMSCs可以在三維支架上分化為血管內皮細胞。hCMSCs可以在膠原海綿中增殖并且分化為血管內皮細胞，膠原海綿具有良好的生物相容性，兩者在組織工程血管化研究中均具有廣闊的應用前景。細胞的分化受到局部微環境的影響，三維條件下培養細胞的生存環境更接近體內，從而有利于細胞基質的分泌，增加細胞與細胞、細胞與材料之間接觸面積，有利于細胞之間的相互作用、促進細胞增殖和新陳代謝廢物的排除[10]。