參芪蛭龍湯對大鼠膜性腎病的實驗研究

薛丕良,張玉昆，袁茵，白茹，劉欣欣，鄧思瑤， 黃雅晨，肖洪彬，牛雯穎*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150042；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)又稱膜性腎小球腎炎(membranous glomerulonephritis,MG)，是腎病綜合征常見的病理類型之一。該病理類型的特點是腎小球上皮細胞下彌漫的免疫復合物沉積伴基底膜彌漫增厚。在臨床上約70%～80%的膜性腎病患者以腎病綜合征為表現形式，大多數病人腎功能正常或少數輕度受損，臨床上該病動靜脈血栓發生率較高，尤其以腎靜脈血栓最為常見。目前膜性腎病發病呈上升趨勢，嚴重危害人類的健康，臨床上使用參芪蛭龍湯取得較好的治療作用。本實驗旨在觀察參芪蛭龍湯對陽離子牛血清白蛋白致大鼠膜性腎病的藥效學作用，為臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量(228±19)g。由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號 SCXK(黑)2008004。

1.2 受試藥物

參芪蛭龍湯中藥飲片由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房提供。

1.3 儀器

C2000-A全自動血凝儀(北京普利生儀器有限公司)，LBY-N7500B全自動血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)，XS-500i全自動血液分析儀(希森美康醫用電子上海有限公司)，魅力2000型全自動生化分析儀(美國百昂集團儀器公司)。

1.4 試劑

纖維蛋白原(FIB)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒(上海長島生物技術有限公司，批號分別為1804041、1807016、1805062、1801008)；白蛋白(Alb) 、總蛋白(TP)、肌酐(CRE)、尿素氮(VREA)、葡萄糖(GLU)、膽固醇(CHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT/GPT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST/GOT)測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為171419、171341、183531、183537、183642、182011、167651、170641、170541、182661、171351)。

2 方法

2.1 制備陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)

參照Border法[1-2]，取67 mL無水乙二胺(EDA)液，加入500 mL雙蒸水，再加入6 mol/L鹽酸350 mL，調整pH值到4.75，冷卻至25℃，進行攪拌，再加入天然牛血清白蛋白(N-BSA)5 g溶于25 mL重蒸餾水的溶液，攪拌完全后再加1.8 g炭化二亞胺鹽酸鹽(EDCHCL)維持25℃，持續攪拌2 h，保持pH值4.75，最后加4 mol/L(pH值4.75)的醋酸緩沖液30 mL，終止反應，即得到等電點提高的C-BSA溶液。將C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的雙蒸水透析72 h(3～5 h換水1次)，冷凍干燥后，即得BSA干粉。用聚丙烯酰胺等測定其等電點(PI)，PI>8.5即可。C-BSA保存于-40℃備用。

2.2 模型制作

取Wistar大鼠40只，在實驗前置于實驗室(環境溫度26℃，相對濕度60%)適應環境，一周后，將大鼠分別置代謝籠中，接24 h尿測尿蛋白；眼眶靜脈采血，分離血清，測白蛋白、血清總膽固醇、甘油三酯、肌酐和尿素氮。

預免疫：對尿蛋白陰性的大鼠，留出10只作空白對照，對其余大鼠進行預免疫。將80 mg C-BSA溶于15 mL PBS中，與等量弗氏不完全佐劑混合，超聲乳化完全后進行預免疫。除空白對照組外，于每只大鼠腹股溝、腋窩等處進行多點皮下注射，每只0.3 mL的乳化物，每點注射不超過0.05 mL。正常對照組則以PBS與弗氏不完全佐劑按上述比例乳化后進行皮下注射。一周后，進行正式免疫(制作模型)：每次將C-BSA溶于1 mLPBS中進行尾靜脈注射，首次C-BSA尾靜脈注射量為3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周內緩慢將注射量遞增至5 mg/只，正常對照組注射同體積的PBS。6周后留取動物24 h尿，測血清白蛋白、血清總膽固醇、甘油三酯確定動物模型成功[1-2]。

2.3 中藥制備

參芪蛭龍湯處方組成：黨參20 g，黃芪30 g，當歸15 g，川芎15 g，水蛭5 g(研末沖服)，地龍20 g，白僵蠶15 g，虎杖15 g，淫羊藿30 g，鳳尾草15 g。制法：以上10味，加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，濾過，再加10倍量水煎煮1 h，濾過，濾液合并，濃縮成1∶1 4℃儲存備用。

2.4 分組和給藥

尿蛋白陰性未進行模型制作的10只大鼠分為空白組，其余制作膜性腎病模型大鼠30只，隨機分為3組，即模型組、中藥低劑量組和中藥高劑量組。空白組：給予與參芪蛭龍湯組同等量的生理鹽水；模型組：給予與參芪蛭龍湯組同等量的生理鹽水；中藥低劑量組：根據人(70 kg)的給藥量換算成大鼠給藥劑量約為4 g生藥/kg，灌胃；中藥高劑量組：根據人(70 kg)換算成大鼠給藥劑量約為8 g生藥/kg，灌胃。在造模2周后開始給予中藥湯劑早晚各1次，連續給藥4周。

2.5 檢測指標

各組大鼠于治療4周結束時先留取24 h尿，之后用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血。

2.5.1 檢查生化指標

取枸櫞酸鈉抗凝血離心(3 000 r·min-1，10 min)取血漿，全自動生化分析儀對血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)、谷丙轉氨酶(AlT)、谷草轉氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)測定。

2.5.2 檢查血常規

取EDTA-K2抗凝血對白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)計數測定。

2.5.3 全血黏度和血漿黏度的測定

取肝素抗凝血1 mL離心(3 000 r·min-1，10 min)，取血漿用于全血黏度和血漿黏度測定。

2.5.4 凝血4項的測定

取枸櫞酸鈉抗凝血的血漿按照試劑盒說明書測定。FIB、PT、TT和APTT。

2.5.5 24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)測定

留取大鼠24 h尿液，采用雙縮脲法測定24-UTP。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 生化指標的測定

3.1.1 肝功指標

與空白組比較，模型組TP、ALB含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組TP、ALB含量呈上升趨勢(P>0.05)；中藥高劑量組TP、ALB含量顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，3組AST、ALT均無顯著變化(P>0.05)。結果見表1。

表1 中藥高低劑量組對大鼠肝功的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

3.1.2 血脂含量的測定

與空白組比較，模型組TC、HDL-C含量顯著上升(P<0.05)，TG含量顯著上升(P<0.01)。與模型組比較，中藥高低劑量組TC含量均顯著下降(P<0.05)；中藥低劑量組TG含量呈下降趨勢(P>0.05)，中藥高劑量組TG含量顯著下降(P<0.05)；中藥高低劑量組HDL-C含量無明顯變化(P>0.05)；3組LDL-C含量均無顯著變化(P>0.05)。結果見表2。

表2 中藥高低劑量組對大鼠血脂含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05,△△P<0.01

3.1.3 血糖、尿素氮和肌酐的測定

與空白組比較，模型組GLU含量無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，中藥低劑量組GLU含量升高(P>0.05)，中藥高劑量組GLU含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，3組BUN、Scr含量均無明顯變化(P>0.05)。結果見表3。

表3 中藥高低劑量組對大鼠GLU、BUN、Scr含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

3.2 血常規測定

與空白組比較，模型組RBC計數下降明顯(P<0.01)；PTL計數升高明顯(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組RBC計數上升(P>0.05)；中藥高劑量組明顯升高(P<0.05)；中藥高低劑量組PTL計數明顯下降(P<0.05)；3組WBC含量均無明顯變化(P>0.05)。結果見表4。

3.3 凝血四項的測定

與空白組比較，模型組FIB含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組FIB含量下降(P>0.05)；中藥高劑量組FIB含量明顯下降(P<0.01)；3組TT、APTT、PT含量均無明顯變化(P>0.05)。結果見表5。

表4 中藥高低劑量組對大鼠WBC、RBC、PLT計數的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

表5 中藥高低劑量組對大鼠凝血四項含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

3.4 全血黏度和血漿黏度的測定

與空白組比較，全血黏度高切200 s-1模型組全血黏度明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，中藥高低劑量組全血黏度呈上升趨勢(P>0.05)；3組血漿黏度和全血黏度低切3 s-1、中切60 s-1無明顯變化(P>0.05)。結果見表6。

表6 中藥高低劑量組對全血黏度和血漿黏度的影響

注：與空白組比較,△△P<0.01

3.5 尿蛋白定量測定

與空白組比較，模型組尿蛋白定量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組尿蛋白定量呈下降趨勢(P>0.05)；中藥高劑量組尿蛋白定量明顯下降(P<0.05)。結果見表7。

表7 中藥高低劑量組對大鼠尿蛋白定量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

4 討論

近年來，膜性腎病的發病率呈現逐年上升的趨勢。當前該病的西醫治療手段主要是糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑等。2012年KDIGO指南提出，不推薦單獨使用糖皮質激素作為治療原發性膜性腎病(IMN)的首選治療方案[3]，推薦激素聯合免疫抑制劑有一定的臨床價值。目前糖皮質激素常常聯合的免疫抑制劑為烷化劑、鈣調磷酸酶抑制劑、嗎替麥考酚酯和來氟米特等。常用的烷化劑為環磷酰胺和苯丁酸氮芥，研究表明環磷酰胺更有效且毒性更小。環磷酰胺的免疫抑制作用，主要是通過降低T淋巴細胞和B淋巴細胞的數量，尤其對B淋巴細胞的作用更為明顯。臨床研究顯示：口服潑尼松第1個月1 mg/(kg·d)、在第2、3個月左右逐漸開始減量；同時每月使用環磷酰胺沖擊，沖擊方案為0.6 g/d,連用2 d,靜脈滴注，該方案治療IMN，不良反應較小，安全性相對較高[4]。臨床上烷化劑治療IMN取得不錯的療效，但是由于其短期和長期的毒副作用限制了該藥在臨床上的廣泛使用[5]，尤其是長期使用所引起的不可逆的性腺毒性和癌癥[6]。鈣調磷酸酶抑制劑(CNI)主要通過抑制鈣調磷酸酶，從而阻止T淋巴細胞核因子的信號激活，抑制T淋巴細胞活化，此類的代表性藥物有環孢素A(CSA)和他克莫司(FK506)。文獻研究報道，IMN患者使用小劑量的環孢素A 6個月以上，能夠有效地控制病情，達到完全緩解，且不容易復發[7]。最近幾年，FK506廣泛應用于腎臟病領域，尤其在膜性腎病的治療中取得較好的療效，具有起效快、副作用少的優勢。國內外多項研究也進一步證實，FK506與環磷酰胺和驍悉相比，能更快緩解膜性腎病患者蛋白尿，同時升高血漿白蛋白，因此臨床上FK506可作為膜性腎病的首選藥物。國外一項研究顯示，FK506與環磷酰胺在治療IMN上，臨床緩解率分別為85%和65%[8]。文獻報道CNI治療IMN患者，復發率較高，即使療程延長至18或24月后停藥，復發率仍然在50%左右，提示延長用藥時間或許并不能減少該類藥物停藥后的復發率。如果患者病情復發重新使用初始的治療方案也有效[2]。目前膜性腎病常用的治療方案是小劑量激素聯合FK506，但是停藥后復發率比較高。

綜上所述，雖然西醫對該病治療有一定的療效，但也有明顯的副作用，停藥后容易復發。中藥對該病的治療取得較好的療效，沒有明顯的毒副作用，參芪蛭龍湯是在廣泛查閱文獻，總結歷代醫家經驗的基礎上，反復遴選，精簡藥味，并應用臨床多年的經驗方，療效確切。膜性腎病基本病機以脾腎虧虛為本，濕濁瘀血為標，方中黨參、黃芪補益脾氣，淫羊藿補益腎陽，鼓舞腎氣，為君藥；當歸、川芎活血化瘀，水蛭、地龍、白僵蠶蟲類入絡，化瘀消癥為臣藥；虎杖、鳳尾草活血化瘀，利水消腫為佐藥；全方共湊補益脾腎，化瘀利濕之效。現代藥理研究證實[9]黃芪具有降低蛋白尿、提高血漿白蛋白、調節脂代謝、改善高凝狀態、增強機體的免疫功能。水蛭具有抑制血小板活化、抗血栓、改善血液粘稠度、降低血脂等藥理作用[10]。動物實驗證實，川芎嗪能夠減少膜性腎病大鼠腎小球免疫復合物的沉積，抑制基底膜增厚，降低血肌酐及尿素氮水平[11-12]。地龍類藥物能使陽離子牛血清白蛋白誘導的腎炎大鼠尿蛋白減少，血漿白蛋白升高，腎臟病理損害減輕[13]。當歸可以降低血小板聚集、降低血脂、改善腎組織的血液灌注，減輕腎臟組織的缺氧性損傷[14-15]。

實驗結果表明,參芪蛭龍湯明顯降低尿蛋白、升高血清總蛋白和白蛋白的作用；參芪蛭龍湯改善膜性腎病大鼠高脂高凝狀態，升高血糖，無明顯肝腎毒副作用。