天津博物館文物庫房部分文物與囊匣中霉菌的分離與鑒定

張艷紅，劉自軍，劉根亮，李 彬，潘 皎，馬清林

(1． 天津博物館，天津 300201； 2． 分子微生物學與技術教育部重點實驗室(南開大學)，天津 300071； 3． 南開大學生命科學學院微生物系，天津 300071； 4． 山東大學文化遺產研究院，山東濟南 250100 )

0 引 言

館藏文物中的書畫、古籍、紡織品和竹木漆器等有機質文物，常常遭受霉菌的破壞。霉菌在生長代謝過程中產生的有機酸會使文物材料遭到酸腐蝕，且代謝產物可能污染文物表面形成單一色或混合色的霉斑；有機質文物材料作為營養基被微生物分解，使文物機械強度顯著下降，這是文物遭到破壞的原因之一。絲狀真菌通過發達的菌絲體覆蓋文物，并向文物內部滲透吸收營養，對文物造成機械破壞[1]。對文物表面霉菌的鑒定與研究是文物保護工作的重要內容，也是實施有效防治措施的基礎。例如，馬淑琴[2]對發霉書畫文物做實驗分析，發現霉菌種類有黑曲霉、黃曲霉和綠色木霉等；唐歡等[3]采集的書畫污染霉菌有曲霉屬，如黑曲霉、黃曲霉和米曲霉。申艾君等[4]對館藏竹木漆器文物表面霉斑進行實驗研究，鑒定出曲霉屬和脈孢菌屬等霉菌。2016年初，天津博物館文物庫房的部分有機質文物中有明顯的菌斑出現，針對這些霉菌進行采樣、培養、分離與鑒定，以期為今后的防治工作提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1培養基 霉菌的分離純化使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，自然pH(配完培養基后不用調節pH，PDA培養基的自然pH為7.0左右)。

1．1．2主要試劑 50 mol/L Tris-HCl(pH 8)，10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，苯酚，氯仿，異丙醇，無水乙醇等購自北京伊諾凱科技有限公司。RNaseA(TakaRa)，Transtaq-T DNA聚合酶等購自大連寶生物工程公司。Trans 2K Plus DNA標記，10×PCR緩沖液，6×DNA Loading緩沖液等購自北京全式金生物技術有限公司。

1．1．3主要儀器 DL-CJ-1NDII型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；HVA-85型高壓滅菌鍋(日本HIRAYAMA)；Nikon ECLIPSE 80i型生物顯微鏡；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；電熱培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；全溫恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；PCR擴增儀(Mastercycler gradient，Eppendorf公司)；凝膠成像儀(ChemiDocTM XRS，Bio-Rad公司)等。

1．2 方法

1．2．1樣品采集 天津博物館文物庫房位于地下一層，面積約11 000 m2，收藏文物近20萬件。2016年初，在A1庫、A8庫、A18庫和C7庫內的部分囊匣(其內部保存的文物表面未出現霉斑)和文物上發現霉斑。4月7日，針對這4個庫房內的霉斑進行采樣分析，采樣方式為無菌棉簽蘸取菌斑，然后在PDA培養皿中劃線，其中樣品(a)取自A8庫房的紙質書畫囊匣，樣品(b)和(c)分別取自A1庫房的木質筆筒囊匣和木質漆盒文物，樣品(d)、(e)和(f)分別取自C7庫房的藏式皮箱-1、藏式皮箱-2和雕花鳥紋方桌，各個樣品特征見圖1。

1．2．2霉菌的分離 將取回的樣品置于28 ℃培養箱中培養5 d，PDA平板上出現絲狀真菌。選擇分離效果明顯，菌落形態、顏色多樣的平板，分別挑取單菌落進行劃線純化，分離2～3次。純化得到的菌株置于4 ℃保存備用。

1．2．3DNA的提取 對純化得到的真菌進行液體培養，菌絲尖端接種轉接到PDA液體培養基中，28 ℃下120 r/min搖床培養2 d，利用真空抽濾泵獲取菌絲，提取DNA采用CTAB法[5]。

1．2．4ITS序列的擴增 真核生物ITS序列(Internal Transcribed Spacer)具有廣泛的序列多態性，即使是親緣關系非常接近的兩個物種在ITS序列上也會表現出差異，廣泛應用于真核生物的鑒定中。擴增真核生物ITS序列使用引物ITS1(5’-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(5’-TCCTC CGCTTATT GATATGC-3’)[6]。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR過程在50 μL的體系中(10×PCR緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物4 μL，10 mmol/L ITS1 2 μL，10 mmol/L ITS4 2 μL，DNA 2 μL，5 U/μL Transtaq-T DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL)進行擴增。PCR反應程序為預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，反應30個循環，延伸72 ℃ 10 min。

1．2．5PCR產物的純化與測序 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢PCR產物，將得到的PCR產物均采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit進行純化回收。將純化后的PCR產物送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，將測序結果提交到GenBank，采用NCBI Blast功能進行同源比對，采用以下標準(s：待測序列與數據庫中序列的相似度)。真菌ITS基因間隔區：s≥99%為同種；95%

2 結 果

2．1 分離純化與形態觀察

通過2～3次的平板劃線分離，從不同的文物表面共分離出14株真菌，利用Nikon ECLIPSE 80i型生物顯微鏡對其進行觀察分析。從菌落形態、顏色、生長速度以及顯微形態初步分為A類(菌株TJM 2、4、6、9、10和11)、B類(菌株TJM 7和8)、C類(菌株TJM 12和13)、D類(菌株TJM 1)、E類(菌株TJM 3)和F類(菌株TJM 5和14)，共6類，各類的形態特征見圖2。

2．2 分子生物學鑒定結果

對測序獲得的14株菌株的ITS序列與GenBank數據庫中的已知的ITS序列進行同源性比對，待測菌株與數據庫中參照序列的同源性大于或等于99%(菌株TJM 3和菌株TJM 6與數據庫中參照序列的同源性分別是98%和94%)，分別對應毛殼菌屬(Chaetomium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、畸枝霉屬(Malbranchea)、派倫霉屬(Peyronellaea)和Comoclathris(暫無對應的中文名稱)。將獲得的14株菌株的ITS序列提交到NCBI GenBank，獲得登錄號KY823597-KY823610。每個菌株的比對結果如表1所示。

表1 14株菌株的ITS序列同源性比對

(續表1)

注： 樣品a和c未培養出真菌。

在本次采樣的4個庫房中，A1庫和C7庫的樣品培養分離出了霉菌，其余兩個庫房沒有分離出菌種。A1庫的文物囊匣上分離出三株霉菌，鑒定結果是毛殼菌屬、派倫霉屬和Comoclathrissp．。C7庫的三件文物上分離出11株霉菌，其中藏式皮箱-1上分離出五株，鑒定結果是毛殼菌屬、曲霉屬和枝孢屬；藏式皮箱-2上分離出四株，鑒定結果是毛殼菌屬、曲霉屬、畸枝霉屬，雕花鳥紋方桌上采樣鑒定結果是毛殼菌屬。本次實驗結果表明，毛殼菌屬菌株數量最多，在A1庫和C7庫均有出現；C7庫內文物表面滋生霉菌狀況最為嚴重，亟待采取有效防治措施。

3 討 論

一些霉菌不僅對人體有直接影響，同時也是侵害不同質地文物的重要真菌[8]，其可分解各種有機物質，輕則損害文物的機械強度或展示效果，重則導致文物面貌全非[9]。因此，對霉菌種屬的鑒定可以更有針對性地選擇和使用抑制劑，為后續的微生物防治工作提供一定依據。本實驗分離得到14株霉菌菌株，通過形態學觀察及真菌ITS序列進行序列比對分析，將其鑒定為毛殼菌屬、畸枝霉屬、曲霉屬、派倫霉屬、枝孢屬和Comoclathris。其中毛殼菌屬數量最多，占到了6株。毛殼菌屬廣泛分布于自然界中各種含纖維素的基物上，是造成紙類和其他含纖維素材料生物降解的主要病害真菌之一[10-11]。球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)是毛殼菌屬的一種，其適宜生長溫度是18～28 ℃，高于37 ℃不能夠生長；適宜生長的pH值為6～8[12]。曲霉屬更是分布廣泛，土壤和各種有機物上均有分布，在諸多博物館中，也常會有曲霉屬的檢出[13-15]。黃曲霉(Aspergillusflavus)最適生長溫度為37 ℃，且在12～48 ℃的溫度范圍內均可生長。黃曲霉可分泌Ⅰ型和Ⅱ型α-D-木糖苷酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶和脂酶等其他酶類，在侵染寄主的過程中降解寄主組織，提供豐富的營養成分[16]。樟絨枝霉(Malbrancheacinnamomea)是畸枝霉屬的一種，其最適生長溫度為45 ℃[17]，屬于嗜熱真菌，能同時分泌多種纖維素降解酶[18]。派倫霉屬可產生纖維素酶、蛋白酶和果膠酶，可在較寬的pH范圍(2.0～9.5)營養液中生長[19]，菌絲生長和產孢最適溫度都為25 ℃[20]。

本次實驗涉及的文物材料均為有機質，用于保存書畫、木質筆筒和硯臺等文物的囊匣為傳統工藝制作，所用材料有紙板、紡織品和棉質填充物等。藏式皮箱為木質箱體，外表覆蓋一層皮質。雕花鳥紋方桌屬于木質文物。霉菌對不同質地文物材料的腐蝕破壞過程不盡相同，現以紙張、木質文物、顏料和皮質文物為例進行分析。紙張和木質文物屬于植物纖維，主要由纖維素、半纖維素和木質素等組成，其中纖維素在霉菌分泌的多種生物酶作用下，會發生一系列水解反應，生成單糖葡萄糖。由于生成的葡萄糖不穩定，徹底氧化后會釋放能量，部分能量儲存在機體內供微生物生理活動的需要，部分以熱的形式散發出去[21]。從而引起溫度和濕度的變化并導致霉菌生長繁殖的加速，引發惡性循環[22]，對文物造成進一步的損害。繪畫顏料分為礦物顏料和植物顏料。顏料層往往是彩繪類文物的主要部分和精華所在。礦物顏料中的膠結材料為有機膠粘劑，這些是霉菌繁殖的物質基礎。霉菌形成的可溶性色素直接造成彩繪色度的改變，在生長代謝過程中形成大量的草酸鹽[23]，并使顏料晶體的晶形發生變化[24]。微生物的作用可使鉛丹的價態改變，在鉛丹的色變中起著重要的作用[25]。皮質文物主要是由蛋白質和脂肪組成，皮質中的蛋白質被霉菌分泌出的蛋白酶(特別是一些能水解膠原纖維的酶類)水解為可以溶于水的小分子氨基酸，皮質中的脂肪類物質被霉菌分泌出的酯酶分解為小分子的甘油和脂肪酸等物質，以及皮質中還存在的少量的無機物質等，都會成為霉菌所需的營養源[26]。霉變過程不僅影響皮質文物的外觀，而且會顯著降低其物理力學性能[27]。

本次實驗的采樣時間在2016年4月初，此時北方冬季供暖已經結束，夏季供冷還未開始，空氣濕度處于一年中相對干燥的時期。在對菌斑進行采樣時，A1庫內溫度為20.5 ℃，相對濕度為53.2%；C7庫內溫度為20.9 ℃，相對濕度為50.3%。通過對庫房內溫濕度的連續監測發現，2016年上半年多數庫房的溫度在16～24 ℃的范圍內，相對濕度在40%～80%的范圍內[28]。值得注意的是，C7庫中藏式皮箱和方桌是2012年由海關移交入庫收藏的同批次文物，該批文物在入庫前進行了消毒處理。對于此次霉菌爆發的原因，受短期內空氣濕度的影響可能不大，需要對長霉文物與囊匣的使用材料、制作工藝和保存狀況等進行綜合分析。

霉菌的治理與預防是一項棘手的工作，由于霉菌的生長與濕度、空氣運動和溫度有關，當相對濕度大于70%，即便保持低溫，也很有可能導致霉菌滋生；在空氣流通狀況差的區域，相對濕度不應超過65%，以免藏品發霉[29]。在今后需繼續加強庫房溫濕度、污染氣體和霉菌等環境因素的長期監測[30]，結合對發霉有機質文物材料成分分析與霉菌鑒定的科學實驗，試圖解釋有機質文物中霉菌發生原因，以期對以后的霉菌防治工作提供科學依據[31]。

4 結 論

在對天津博物館文物庫房中部分文物與囊匣上出現的霉斑進行采樣、培養、分離和鑒定后發現，毛殼菌屬數量最多，曲霉屬次之，多數為能對文物產生危害的常見菌種。這些菌種能在不同文物質地和囊匣上生長，且能適應文物庫房的溫濕度等環境條件，如何對其實施有效防治是迫切需要解決的問題。本實驗過程中，利用分子生物學的方法將病害直接鑒定到屬的水平，較形態學鑒定更快速高效。由于采樣點有限，分離得到的病害真菌種類少，不能全面反應文物庫房的真菌污染情況；且所分離得到的真菌絕大部分是從文物材料表面直接取樣得到的，今后可與空氣中真菌取樣實驗加以對比研究。