浙江大盤山華頂杜鵑菌根真菌的分離和鑒定

劉 亞，王 盼，周鈺鴻，陳江芳，陳子林，唐光大

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浙江大盤山華頂杜鵑菌根真菌的分離和鑒定

劉 亞1，王 盼2，周鈺鴻2，陳江芳3，陳子林2，唐光大4

（1. 浙江省磐安縣風景旅游管理局，浙江 磐安 322300；2. 浙江省大盤山國家級自然保護區管理局，浙江 磐安 322300； 3. 磐安縣林業局，浙江 磐安 322300；4. 華南農業大學 林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642）

于2016年5月在浙江省大盤山國家級自然保護區的3處采樣地，每處采集5株華頂杜鵑的1 ~ 2支側根，培養分離華頂杜鵑的菌根真菌，然后結合菌落形態特征和DNA ITS序列分析進行鑒定。結果表明：華頂杜鵑根系內共分離到165個菌株，分為22個菌落形態類型；結合DNA ITS序列分析，最終分為20個不同的菌種類型，其中19個菌種類型屬于子囊菌門Ascomycota，包括8個屬于糞殼菌綱Sordariomycetes和6個屬于錘舌菌綱Leotiomycetes；3個優勢菌種分別為，和某糞殼菌綱真菌的近緣種，分別占菌株總數的41.82%，22.42%和10.91%；其余17個菌種類型合計只占總數的24.85%。

華頂杜鵑；杜鵑花類菌根；菌根真菌分離；浙江大盤山

菌根是植物根系與部分土壤真菌形成的共生體，能夠協助植物吸收和利用養分，促進植物對土壤營養元素的吸收，增強植物的抗逆性[1-2]。杜鵑花類菌根（Ericoid mycorrhiza，ERM）是一類特殊的內生菌根，杜鵑花科Ericaceae植物在高山、石壁、沼澤[3]等生境均有分布，ERM對杜鵑花科植物的生態適應可能起了重要的作用，同時也促進了杜鵑花科植物在不同生境的物種分化和形成[4-6]。華頂杜鵑于1990年在浙江省天臺縣華頂山被發現[7]，新種發表時該物種被指定了2份模式標本，2005年進行了訂正[8]。該物種是浙江省特有植物，發現時僅有200余株，已于2012年4月被浙江省人民政府列入《浙江省重點保護野生植物名錄（第一批）》。近年來，在浙江省磐安大盤山、寧波四明山、金華北山、寧波奉化等地也陸續發現了華頂杜鵑，但種群數量小，屬于衰退型[9]，整體遺傳多樣性水平低[10-11]。華頂杜鵑主要生長在海拔750 ~ 1 150 m的光照較強的陽坡，土壤干旱貧瘠，菌根對其適應生境可能有一定的貢獻。本研究采用人工培養根段分離菌株、菌落形態分類和菌株DNA ITS序列分子鑒定等方法調查華頂杜鵑菌根群落的真菌種類，并找出其優勢菌種，為該物種的幼苗繁殖、遷地保護、壯苗培育和后期開發利用等提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 根系樣品采集

浙江省大盤山國家級自然保護區位于浙江中部的磐安縣，是我國目前唯一以野生藥用生物資源為主要保護對象的國家級自然保護區。保護區為亞熱帶季風氣候，以常綠闊葉林為地帶性植被，年平均氣溫為13.9 ~ 17.4℃，年均降水量1 427.8 mm，年均日照1 827.6 h，年均無霜期192 d，年均結冰期47 d，土壤主要有紅壤、黃壤、水稻土，是華頂杜鵑在其模式產地之外發現的第一個自然分布點[12]。2016年5月在保護區內海拔800 ~ 1 000 m的牛角尖（120°31￠18.62E，28°58￠14.72N）、高姥山（120°32￠41.62E，28°53￠43.82N）、毛塢（120°31￠52.302E，28°59￠7.72N）3處采樣地，每處采集5株華頂杜鵑的根系，每株采集1 ~ 2支側根，將側根連同側根上的細根和泥土一起，保濕置于冰壺內帶回實驗室。

菌根分離培養基采用改良的馬丁-孟加拉紅培養基[13]，配方為：葡萄糖10 g、胰蛋白胨5 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、孟加拉紅0.033 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH值至5.0，然后121℃高壓滅菌20 min，冷卻至60℃以下時加入0.03 g鏈霉素混合均勻。

菌落形態觀測采用pH值調節為5.0的MEA培養基，配方為麥芽提取物20 g、胰蛋白胨1 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH值至5.0，然后121℃高壓滅菌20 min，冷卻至60℃以下時加入0.03 g鏈霉素。試驗所用的葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、孟加拉紅、瓊脂均為分析純；胰蛋白胨、麥芽提取物為生物試劑（英國Oxoid公司生產）。

1.2 菌種分離和觀測

采用根段直接培養法進行菌根分離。清洗和挑選直徑在1.0 mm以下的細根，在超凈工作臺下置于75%乙醇中，浸泡15 s，無菌水漂洗3 ~ 5次；再在10 %的家用84消毒液中浸泡15 min，無菌水漂洗3 ~ 5次。把根系剪成長約0.5 cm的小段，用無菌濾紙吸干水滴，每個平板5條根段，置于分離培養基中培養。用接種棒蘸取少量最后一遍漂洗根系的無菌水，均勻涂抹于一個平板，作為對照，排除雜菌。把培養根段和對照的平板置于25℃培養箱中，黑暗培養14 ~ 28 d。每個樣地分別培養60個根段。試驗所用75%乙醇為分析純；家用84消毒液選用藍月亮牌84消毒液，有效成分為次氯酸鈉，有效含氯量8 000 ~ 10 500 mg·L-1。

待菌落從根段中長出，用接種針挑取菌絲，置于MEA培養基上，培養7 d后，觀察菌落形態的一致性和均勻性。若菌落形態有差異，進行二次分離，如此反復直至純化。把純化后的菌株接種至MEA培養基上，置于25℃培養箱中，黑暗培養3個星期。根據菌落形態特征進行描述記錄和分類，測量指標包括菌落直徑、顏色、質地、邊緣、是否有液體分泌物等[14-16]。

1.3 菌株分子鑒定

從每一個菌落形態類型中根據所擁有菌株的數量多少隨機挑選部分菌株進行DNA ITS序列分析。菌株DNA提取參考莊彩云等[17]的方法。

DNA ITS區段的PCR擴增采用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應體系為2×PCR Buffer（Mg2+，dNTP plus）（TaKaRa）12.5 μL，引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，rTaq酶（1.25 U·μL-1）（TaKaRa）0.5 μL；ddH20定容至25 μL。PCR反應循環參數為：98℃預變性3 min，98℃變性30 s，50℃退火30 s，68℃延伸1 min，68℃延伸7 min，38個反應循環。

PCR產物純化后送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司直接測序。把得到的序列提交至GenBank數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），進行Blast相似性比對，選取并下載相似度排在前列的序列。在MEGA6軟件中用ClustalW程序進行序列比對和人工校正，對比對后的序列矩陣采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）和貝葉斯推理法（Bayesian inference，BI）進行分析，ML采用CIPRES（https://www.phylo.org/portal2/home.action）中的RAxML-HPC2 on XSEDE（8.2.10）程序分析，在Bootstrapping phase中選擇GTRGAMMA模型，用Bootstrap自檢檢驗法進行評估，1 000次重復；BI采用MrBayes on XSEDE（3.2.6）程序分析，在篩選出最優模型的情況下，馬科夫鏈-蒙特卡洛值（Markov chain Monte Carlo，MCMC）分別取10 000 000、抽樣頻率為100；計算值分裂頻率平均標準差（Average standard deviation of spl-it frequencie）值小于0.01為止，并計算各分支的后驗概率值（Posterior probability，PP），獲得BI拓撲樹。

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征觀測

3個采樣地的華頂杜鵑根系內共分離到165個菌株，其中牛角尖采樣地66個，高姥山采樣地50個，毛塢采樣地49個。依據菌株在MEA培養基上25℃黑暗條件下培養21 d的菌落形態特征，分離得到的菌株分為22個類型。其中7個類型的菌落顏色屬于白色、乳白、淡黃色等淺白色系，13個類型的菌落顏色屬于淺灰、灰、深灰、深褐、青棕、黑等深灰色系，2個類型的菌落顏色正面是淺白色系，背面是深灰色系；15個類型的菌落質地呈絨氈狀，4個類型的菌落質地呈薄蠟狀，3個類型在兩者之間；2個類型的菌落在培養過程中出現透明狀的分泌物（圖1，表1）。

圖1 菌落形態特征分類

Figure 1 Colonial morphological characteristics of mycorrhizal fungi

表1 菌落形態特征分類

2.2 菌株的rDNA ITS序列分析

從22個菌落形態類型的165個菌株中挑選了43個菌株進行DNA ITS序列分析，每個類型1 ~ 7個代表菌株，PCR擴增得到的ITS序列長度范圍在487 ~ 679 bp之間。把所獲得的序列提交至NCBI數據庫進行Blast比對，選取相似度高于93%的數據庫序列（表2），并以親緣關系相對較遠的裂褶菌（Genbank登錄號EF155505.1）為外類群[14]，構建系統發育樹（圖2）。

表2 菌株的rDNA ITS序列BLAST結果

表2 續

菌落形態類型菌株編號親緣關系最近的菌種Genbank登錄號比對覆蓋率/%序列相似率/% T13D-7-2；G-10-1；G-4-3；Z-3-2；Z-4-4；Z-6-2；Z-9-3Ilyonectria radicicolaFJ481036.110099 T14D-1-1；D-6-2；D-7-6Paraphaeosphaeria neglectaJX496038.110099 T15Z-5-1；Z-6-3Ascomycota sp.KP689247.110099 T16D-1-4；D-10-3Pezicula ericaeKX440131.110099 T17D-10-1；G-9-2；Z-7-3；Z-9-1Sordariomycetes sp.KF428561.19499 T18D-9-3Ericoid mycorrhizal sp.AY046402.16994 Helotiales sp.KC180690.16494 T19G-8-3Sordariomycetes sp.AB847015.1100100 T20G-4-5Sordariomycetes sp.KF428561.49499 T21D-1-2；G-10-2；Z-4-1；Z-10-2Phialocephala fortiniiEU888627.19999 T22Z-6-5Uncultured Cladophialophora cloneFJ440877.19899

圖2顯示，利用ML和BI構建的系統發育樹的拓撲結構一致。43個代表菌株聚為20個分支。屬于同一菌落形態類型T1的菌株D-1-5，D-5-2和T2的D-10-2，Z-10-1在ML系統發育樹中各自聚為4個不同的分支。而不同菌落形態類型T5，T12，T17，T20的菌株在ML系統發育樹中聚為1個分支，T4，T7的菌株聚為1個分支。其余不同菌落形態類型的菌株在ML系統發育樹中各自聚為1個分支。

圖2 基于菌株及其相似真菌的rDNA ITS序列構建的ML和BI系統發育樹（節點的數值分別代表PP和BPML）

Figure 2 ML and BI phylogenetic tree based onDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi and similar fungi from the Genbank

2.3 菌根真菌鑒定結果

結合菌落形態分類和代表菌株的DNA ITS序列分析結果，此次菌根分離得到165個菌株為20個不同的菌種類型（表3）。除了1個菌種類型N8的分類地位尚不清楚，其余19個菌種類均屬于子囊菌門Ascomycota，其中8個屬于糞殼菌綱Sordariomycetes，6個屬于錘舌菌綱Leotiomycetes。

表3 菌根真菌鑒定結果及菌株數量統計

3個菌種類型N7，N13 和N19的菌株數量遠遠大于其他菌種類型，分別為18，37和69個，占菌株總數的75.15%，是華頂杜鵑菌根的優勢菌種類型。其余17個菌種類型的菌株數量在1 ~ 7個之間，只占菌株總數的24.85%。

3 結論

從浙江省大盤山國家級保護區的華頂杜鵑的根系內，采用人工培養根段的方法分離到165個菌株，分為22個菌落形態類型。結合DNA ITS序列分析，華頂杜鵑的菌根真菌可分為20個不同的菌種類型，其中19個菌種類型屬于子囊菌門，1個未能鑒定類別。

糞殼菌綱和錘舌菌綱的真菌占了華頂杜鵑菌根真菌的大多數，8個菌種類型的71個菌株屬于糞殼菌綱，分別占菌種類型總數和菌株總數的40%和43.03%；6個菌種類型的77個菌株屬于錘舌菌綱，分別占菌種類型總數30%和菌株總數的46.67%。優勢菌種為，和某糞殼菌綱真菌的近緣種，分別占菌株總數的41.82%，22.42%和10.91%；其余菌種的菌株數量較少，17個菌種類型合計只占總數的24.85%。

4 討論

4.1 真菌形態鑒定和分子鑒定方法的比較

真菌種類繁多、形態特征復雜，并且其形態特征常隨著環境變化或菌落生長而變化，因此傳統的形態鑒定方法難度較大。分子鑒定方法以真菌物種的DNA ITS序列為依據，雖然可以定量地分析，但分子試驗價格昂貴，對一些特殊的菌種類型可能難以靠通用引物進行鑒別，依賴Genbank等數據庫中已有同源或近緣菌株的序列信息，并且選取合適的方法和模型進行分子數據分析非常重要[18]。

本研究中由于一些菌落形態特征較難判定，因而對菌落形態分類進行得較為細致，把一些有細微差異的菌株都分為了不同的菌落形態類型，并且選取了較多的菌株進行DNA ITS序列分析，最終將其中6個菌落形態類型經過分子鑒定后被歸并為2個不同菌種，而4個被歸為2個菌落形態類型的菌株經過分子鑒定后發現是4個差異較大的菌種，其余菌株的形態分類和分子分類的結果一致?？梢婋m然菌落形態分類存在一定誤差，但它可作為挑選代表菌株進行分子鑒定的重要參考，從而節約分子試驗成本。通過較為細致的菌落形態分類和選取較多的菌株進行分子鑒定，可以修正菌落形態分類的誤差，從而對大量真菌進行較為準確的鑒定。由于Genbank數據庫中序列信息有限，本研究中3個菌種類型N4，N8，N17并未找到序列相似率在99%以上的株，這些菌種類型的鑒定結果與其準確的系統分類地位應該還有一定差距；4個菌種類型N3，N7，N15，N18雖然分別找到了序列相似率99%的菌株，但僅能鑒定到目或目以上。而除此之外的13個菌種類型，則相對準確地鑒定到了屬或種。

4.2 華頂杜鵑菌根群落真菌組成

隨著研究技術的進步，越來越多的子囊菌門和擔子菌門真菌在杜鵑花科植物的根內被發現，包括sp.，sp.，sp.，枝頂孢屬sp.，sp.，sp.，sp.，粒毛盤菌屬sp.等子囊菌類和sp.，Sebacinales，Serendipitaceae，等擔子菌類，其中子囊菌門盤菌屬sp.，sp.和樹粉孢屬sp.是最常見的杜鵑花類菌根真菌，已被證實能與杜鵑花科植物的根系形成典型的胞內菌絲節結構，并進行直接的營養交換[19]。本研究中菌種類型N4，N10和N16分別是，、（同）的同源或近緣種，但它們分別只占菌株總數的3.64%，1.21%和2.42%，并未在大盤山地區華頂杜鵑的菌根群落里占優勢。本研究中優勢菌種類型N3，N13和N7分別是，和某種未知糞殼菌綱Sordariomycetes真菌的同源或同一種，分別占菌株總數的41.82%，22.42%和10.91%。大量研究表明，以為典型代表的深色有隔內生真菌（Dark septate endophytes，DES）在包括杜鵑花科[20]、松科Pinaceae[21]，蘭科Orchidaceae[22]，豆科Leguminosae[23]在內的多種植物的菌根內都有發現是一種幾乎沒有宿主選擇性的廣譜性菌根真菌，并且對宿主植物具有積極的菌根效益[24]是南美洲巴塔哥尼亞地區（Patagonia）的杜鵑花科白珠樹屬麗果木.和波比白珠樹.的侵染率較高的菌根真菌之一[25]，在云南高黎貢山的大樹杜鵑.var.的根內也曾分離和記錄過，并且是大樹杜鵑部分菌根群落的優勢菌種類型[26]。然而，.及該屬的真菌常對葡萄[27]、鱷梨[28]等多種植物引起嚴重的根腐病。有研究觀點提出，植物與真菌之間的互利共生或致病寄生關系并沒有絕對的界限，而是受環境、生理、基因等多種因素的影響；在特定的條件下，植物與真菌之間的互利共生或致病寄生關系可以相互轉化[29]。.未對華頂杜鵑，麗果木、波比白珠樹和大樹杜鵑等杜鵑花科植物引起病害，同時這些杜鵑花科植物的自然分布區都非常狹小、生境環境特殊。這些杜鵑花科植物是否具有抵抗根腐病的特殊機理，或者.對這些杜鵑花科植物適應特殊環境是否具有關鍵性作用，可做進一步研究和探索。

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Isolation and Identification of Mycorrhizal fungi inRoot in Zhejiang Dapanshan National Nature Reserve

LIU Ya1，WANG Pan2，ZHOU Yu-hong2，CHEN Jiang-fang3，CHEN Zi-Lin2，TANG Guang-da4

（1. Pan’an Administration of Tourism of Zhejiang, Pan’an 322300, China; 2. Administration of Dapanshan National Natural Reserve of Zhejiang, Pan’an 322300, China; 3. Pan’an Forestry Bureau of Zhejiang, Pan’an 322300, China; 4. College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）

Three sample plots were established in Dapanshan National Nature Reserve, Zhejiang province in May of 2016. 5were selected for 1-2 lateral roots each. Ericoid mycorrhiza (ERM) was cultured from collected roots and studied by morphological characteristics and molecular identification ofDNA ITS sequence. The result showed that 165 mycorrhizal fungal strains were isolated which were classified into 22 types based on colony characteristics.DNA ITS demonstrated that these mycorrhizal fungi could be identified into 20 species, among them, 19 species belonging to Ascomycota, including 8 Sordariomycetes, 6 Leotiomycetes. The dominant 3 species were,andsp., respectively accounting for 41.82 %, 22.42% and 10.91% of the total strains. The lest 17 species occupied only 24.9%.

; ericoid mycorrhiza (ERM); Mycorrhizal fungi isolation; Dapanshan National Nature Reserve

10.3969/j.issn.1001-3776.2019.01.001

S685.21

A

1001-3776（2019）01-0001-08

2018-07-24；

2018-11-29

金華市重點科技計劃項目（2017-2-022）資助

劉亞，工程師，從事植物生態與植物旅游開發利用研究工作；E-mail:785480407@qq.com。

唐光大，博士，副教授,從事植物資源和植物生態方面的研究；E-mail:gdtang@scau.edu.cn。