開墾和長期施肥下青海黑鈣土中腐殖質的光譜特征*

張 桐 何小松 李 猛? 劉元元 席北斗 張 慧 李 丹

（1 中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012）（2 重慶大學城市建設與環境工程學院，重慶 400044）

腐殖質是土壤中的重要組成部分，占土壤有機質比重的50%～70%，主要來源于植物殘體或（微）生物體降解和土壤生物化學合成等過程［1］，常起到維持土壤碳平衡、調控土壤肥力、調節土壤理化性質的作用［2］。腐殖質并非單一的有機化合物，而是一系列在組成、結構及性質上既有共性又有差別的有機分子結合而成的復雜“生物超分子”結構，含有豐富的功能基團和有機組分［3］。應用紫外—可見光譜、傅里葉變換紅外光譜和三維熒光光譜分析技術對土壤腐殖質進行綜合表征，可以鑒定其中的有機組分和官能團組成，并解析出腐殖質的性質、來源與功能［4-6］。

土地利用方式的變化和施肥策略常是影響腐殖質結構、性質和功能發生動態變化的關鍵因素［7-8］。有研究表明：土地利用的變化可能導致土壤腐殖質在來源、結構和性質各層面上均發生顯著性改變［9］。而施肥則因其直接改變土壤營養供給和基本理化性質，如pH、陽離子交換量，可能對腐殖質的組成與性質產生重要影響［10］。但目前在開墾和施肥對腐殖質影響的研究上，主要關注于對腐殖質含量的影響，而對腐殖質分子結構和性質影響的研究較少。

青藏高原分布有大面積的高原或高山草甸，在土壤中長期累積了大量的腐殖質。由于農業活動，部分草甸被開墾為農田，并長期施入了化肥或有機肥。在青藏高原高寒環境下，土壤的生態環境較為脆弱，土壤腐殖質的生物化學行為可能對環境變化較為敏感。而目前，土壤腐殖質對開墾與長期施肥的響應尚不明確，因此也對優化土地利用的管理和保持土壤肥力構成了障礙［11］。本試驗選取青海達板山的南麓谷地作為研究區，采取表層土樣，應用紅外、紫外—可見、三維熒光光譜技術表征土壤腐殖質，以研究開墾與長期施肥對青海黑鈣土中腐殖質光譜特征的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣品采集

研究區地處青藏高原寒溫濕潤氣候帶，海拔為2 940～2 980 m，年平均氣溫為0.3oC，常年降雨量為530～560 mm，無絕對無霜期。研究區內分布有大片油菜地及草甸，土壤類型為黑鈣土。

在研究區選取未開墾草甸（M）和不施肥（NF）、施肥13a（F13a）和26a（F26a）的油菜樣地各3塊樣地。其中，油菜地長期種植北方白菜型小油菜（Brassica campestrisL.），種植密度為105萬株·hm-2，其作物生長期為110～120 d，本種植季播種于2017年4月中旬，品種為“青雜五號”。未開墾草甸植被主要為蒿草屬（Kovresia）。其中，每年分6次向油菜地施入無機復合肥（總計施氮 160～270 kg·hm-2·a-1、施磷80～120 kg·hm-2·a-1、施鉀135～225 kg·hm-2·a-1）和牦牛糞便堆肥（9 000 kg·hm-2·a-1）。其中，牦牛糞便堆肥中含碳量為325 g·kg-1、含氮量為19 g·kg-1、含磷量為10.5 g·kg-1。在種植季進行2次漫灌。草甸無施肥和灌溉管理。于10月上旬油菜收割后，在各樣地采取混合表層土樣（0～20 cm），樣品低溫保存并迅速運回實驗室。在去除草根、砂粒后冷凍干燥，研磨過2 mm和0.15 mm尼龍篩，用于土壤理化性質測定和有機質提取。

1.2 土壤理化性質測定

土壤pH采用電極法測定，有機質采用重鉻酸鉀外熱法測定，陽離子交換量（CEC）采用乙酸鈉法測定，碳酸鈣含量采用氣量法測定［12］。土壤粒度采用激光粒度儀（LS 13 320，Beckman Coulter，美國）測定，全氮含量采用元素分析儀（Elementar，德國）測定。

1.3 土壤腐殖質提取

土壤中胡敏酸和富里酸的提取參考國際腐殖質協會推薦的腐殖質提取方法［13］。得到的胡敏酸粗品用超純水洗滌3～5次，以去除Cl-（以AgNO3溶液滴定法檢查），離心后凍干［14］。經純化后的富里酸同樣進行凍干，收集備用。

1.4 腐殖質的光譜表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀（Tensor II，德國布魯克），以KBr壓片法測定腐殖質樣品的紅外光譜。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數為64次。應用OPUS V7.5軟件（德國布魯克）對測得的紅外光譜譜圖進行平滑與基線校正后，分析特征吸收峰的峰高與位移等信息，對特征吸收峰與官能團的鑒定參考相關文獻［14-15］。

腐殖質的紫外—可見光譜應用紫外—可見分光光度計（UV-4802，優尼柯公司，美國）測定稱取約50 mg胡敏酸或富里酸的干燥樣品于50 mL離心管中，加入40 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH=7），振蕩并超聲30 min使其完全溶解。胡敏酸或富里酸溶液則以總有機碳（TOC）分析儀（Multi N/C 2100S，耶拿公司，德國）測定TOC含量，并據此以超純水將溶液TOC濃度逐級調節至10 mg·L-1。以0.1 mol·L-1超純水為空白，應用稀釋液的吸光值。測試時，掃描波長范圍為：190～700 nm，掃描波長間隔為1 nm。測定后，計算稀釋液在254 nm處的吸光值與TOC濃度的比值得到SUVA254，并分別計算其在240 nm與420 nm、250 nm與360 nm處的吸光度比值得到E2/E4與E2/E3。

腐殖質樣品的三維熒光光譜以三維熒光光度計（F-7000，Hitachi，日本）測定。測定時，溶液TOC=10 mg·L-1，激發波長（Ex）范圍為200～450 nm，發射波長（Em）范圍為280～550 nm，掃描速度為2 400 nm·min-1，狹縫寬帶為5 nm。得到的三維熒光譜圖在去除散射后，應用DOMFluor工具箱（MatLab v2017a，美國）以平行因子分析法確定腐殖質中的有機組分及各組分的相對含量［16］，其特征峰的鑒定參考相關文獻［17-18］。

1.5 統計分析

應用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗不同處理間土壤理化性質、腐殖質光譜特性的顯著差異性（SPSS v22，IBM，美國）。應用主成分分析法（PCA）檢驗不同處理間土壤腐殖質中各組分的差異性（XLSTAT v2014，Addinsoft，美國）。

2 結果與討論

2.1 開墾與長期施肥對黑鈣土基本理化性質的影響

青海草甸與油菜地中黑鈣土的pH為8.16～8.77，土壤呈弱堿性（表1）。草甸經開墾后，土壤pH顯著下降（P＜0.05），而長期施肥的土壤具有最低的pH（P＜0.05）。土壤中含有2.7%～5.3%的砂粒、22.4%～26.8%的粉粒、69.2%～72.3%的黏粒，土壤質地可歸為黏壤土。各處理土壤中的砂粒組分因受土壤母質等不均一因素的影響而產生差異性分布，可能會對土壤有機質發育產生影響。草甸土中陽離子交換量（CEC）平均為35.46 cmol·kg-1，高于全國土壤10～20 cmol·kg-1的CEC分布范圍，這可能與青海黑鈣土中含有較高的碳酸鈣有關（平均為18.2～53.6 mg·kg-1）。同時，研究區土壤質地黏重，土壤膠體負電荷量大，所能吸附的Ca2+、Mg2+、Na+等陽離子的能力較強［19］。不施肥而進行長期種植油菜后，土壤CEC顯著降低。而長期施肥則導致CEC的顯著增高（P＜0.05），說明：施肥使得土壤保肥與營養供給能力增強（表1）。草甸土壤中含有平均為113.46 g·kg-1的有機質，開墾后土壤中的有機質含量顯著降低。但相比不施肥，長期施肥的油菜地土壤中有機質含量較高，可能說明施肥減緩了有機質的降低。同時，長期施肥也使得油菜地土壤中全氮含量達0.54～0.91 g·kg-1，顯著高于不施肥油菜地和草甸土壤（P＜0.05）。

表1 不同處理下青海黑鈣土的基本理化性質Table 1 Basic physic-chemical properties of chernozem relative to treatment

2.2 開墾與長期施肥對黑鈣土腐殖質紫外—可見光譜（UV-Vis）特征的影響

紫外—可見光譜（UV-Vis）能有效地反映出腐殖質的特定分子結構，單位濃度的吸收值或特定波長吸收值之間的比值等指標對腐殖質的宏觀結構具有指示意義。一般腐殖質在254 nm處的單位有機碳含量的吸光度（SUVA254）可用于表征腐殖質的腐殖化程度，其數值越大代表腐殖化越強［20］。E2/E3是指腐殖質在250 nm與360 nm處吸光度的比值，可用以表征土壤中腐殖質的相對分子量和芳香化程度，其數值越小代表腐殖質的相對分子量和芳香度越大［21］。土壤腐殖質的E2/E4值則是指其在254 nm和436 nm處的吸光度比值，可用以表征腐殖質的來源，E2/E4值較高表示內源貢獻較大，較小則表示以外源貢獻為主［22］。其中，外源貢獻指的是土壤中的腐殖質是由外源物質如枯枝落葉、生物殘體的腐殖化過程貢獻而來的，而內源貢獻是指在土壤中的微生物作用下將原有的有機質轉化為腐殖質的過程。

對青海黑鈣土中腐殖質進行UV-Vis分析，計算其SUVA254和E2/E3、E2/E4值，結果見表2。相比富里酸（SUVA254=21.78～32.86，E2/E3=3.04～3.66），胡敏酸具有較高的SUVA254（38.59～44.30）和較低的E2/E3值（2.21～3.14）。這可能說明胡敏酸相較富里酸具有更高的腐殖度、較高的相對分子量和芳香性，這一結果與相關研究結果相符［23］。青海黑鈣土中腐殖質E2/E4為4.55～7.02，整體處于較低水平，腐殖質應主要是外源如植物殘體腐解產生。E2/E4在草甸和不施肥油菜地土壤的胡敏酸與富里酸中無顯著性差異（表2）。但在施肥13 a與施肥26 a黑鈣土中，胡敏酸的E2/E4顯著低于富里酸，表明相比富里酸，施肥使得胡敏酸更依賴外源輸入。對比不施肥的油菜地，草甸土壤中胡敏酸具有較高的SUVA254和較低的E2/E4、E2/E3，而富里酸則具有較低的SUVA254。這可能說明草甸經開墾、不施肥處理后，胡敏酸的腐殖化程度、相對分子量和芳香性均降低。而胡敏酸的E2/E4則升高，這可能是由于外源植物殘體輸入的減少導致了腐殖質內源貢獻（如微生物作用）的相對增強。富里酸對草甸開墾的響應與胡敏酸有重要差異。油菜地土壤富里酸較草甸有較高的SUVA254，表明其在油菜種植過程中，腐殖化增強。對比不施肥油菜地，長期施肥（13 a與26 a）下的黑鈣土胡敏酸SUVA254較高，E2/E4和E2/E3則較低，表明長期施肥可能導致了胡敏酸腐殖化程度增強、相對分子量和芳香性增大、對外源依賴性提高（表2）。這可能是因為施肥使得土壤中的碳供給多樣化，有機質分子結構趨向于更復雜。在對長期施肥的響應上，富里酸表現出與胡敏酸較大的差異。施肥后，富里酸SUVA254未發生顯著變化，E2/E4和E2/E3則升高，表明長期施肥可能導致了富里酸的相對分子量和芳香性降低、對內源依賴性提高，其結果可能與微生物活動有關。

表2 土壤腐殖質紫外—可見光譜特性Table 2 UV-Vis spectral properties of soil humus

2.3 開墾與長期施肥對黑鈣土腐殖質傅里葉變換-紅外光譜（FT-IR）特征的影響

應用傅里葉變換-紅外光譜法分析青海黑鈣土腐殖質中官能團的特征吸收峰，結果見圖1。不同處理下胡敏酸與富里酸FT-IR光譜中的官能團特征峰位置未發生變化。黑鈣土中胡敏酸與富里酸的官能團組成類似：在3 410 cm-1波數處的O-H或N-H伸展振動峰，主要來自于碳水化合物、蛋白質或氨基酸［23］；在2 922、2 851 cm-1波數處的脂肪族CH2與CH3伸展振動峰，主要來自細胞膜、細胞壁等組織成分［24］；在1 718 cm-1的羧基C=O伸展振動峰和在1 630 cm-1波數處的芳基C=C伸展振動峰［8］；在1 120～1 240 cm-1波數處的羧基或酯中C-O伸展振動峰［14］；在910～1 080 cm-1波數處的多糖C-O或C-C的特征吸收峰，主要來自于植物、微生物殘體中的碳水化合物［25］。

不同處理間土壤胡敏酸、富里酸的紅外譜圖均具有相似性，但多數特征吸收峰的強度有較大差異（圖1）。油菜地土壤胡敏酸各特征吸收峰強度相比草甸均降低，這與油菜地土壤有機質的降低一致。長期施肥下，胡敏酸的O-H、多糖類C-C和C-O、脂肪族CH和CH3的吸收峰強度弱于不施肥土壤，可能是由于施肥增加了作物生物量而大量消耗了土壤碳水化合物和脂肪族有機物［26］。同時，長期施肥使得油菜地土壤胡敏酸中羧基C=O（1 718 cm-1）和C-O（1 221 cm-1）伸展振動峰的強度相對不施肥土壤增強，可能是由于施肥提高了土壤中羧酸類物質的生成。相比草甸，不施肥油菜地土壤中富里酸的羧酸類、芳香類、多糖類等的特征吸收峰強度均降低。但長期施肥后，土壤富里酸的羧酸類、芳香類、多糖類等的特征吸收峰強度均增強。

圖1 土壤腐殖質的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 1 FT-IR spectra of soil humus

2.4 開墾與長期施肥對黑鈣土腐殖質三維熒光光譜（3D-EEM）特征的影響

應用三維熒光光譜技術分析黑鈣土中腐殖質的熒光光譜，結合平行因子分析法識別出青海黑鈣土腐殖質中的5個有機質組分（圖2），分別為兩個類胡敏酸組分（C1，Ex/Em=260/420；C2，Ex/Em=270/480）、兩個UVC類富里酸組分（C3，Ex/Em=220/420；C5，Ex/Em=240/380）和一個水溶微生物副產物組分（C4，Ex/Em=300/350）［18］。其中，C3和C5組分的峰位置均與紫外光類腐殖質（Ex/Em=220～260/380～460）相似，表明其可在吸收紫外光后發射出較強的熒光且熒光組分的分子量較低［14］。類胡敏酸組分C2中包含可見光類腐殖質（Ex/Em=370/480），多來源為外源腐殖質，分子量相對較高［14］。相比而言，C2的發射波長（480 nm）高于C1（420 nm），說明C2的分子結構更復雜，相對分子量更高［6］。同時，C4含有類蛋白的組分（類色氨酸，Ex/Em=230/340），可能是來源于一部分微生物產生的酶或生物殘體中的蛋白質。整體上，胡敏酸中的主要有機質組分為C1、C2和C5，富里酸中的主要有機質組分為C1和C3，C4在兩種腐殖質中相對含量均較低。

比較不同處理間土壤腐殖質的組成差異，發現開墾使得胡敏酸中C2相對增強、C3與C5相對減弱，表明開墾可能使得胡敏酸分子結構趨向復雜，相對分子量升高（圖3a）。長期施肥使得胡敏酸中C4相對含量顯著降低（圖3b），可能與植物殘體輸入的減少有關。對于富里酸，開墾顯著增強了C1、C3、C5這三個組分的峰強（圖3c），但C3的相對含量隨開墾降低（圖3d），表明開墾有利于富里酸中低分子量熒光組分的生成。同時，開墾也顯著提高了富里酸中的類胡敏酸組分C2的峰強度和相對含量。

圖2 三維熒光光譜分析與平行因子分析獲得的土壤腐殖質組分(C1～C5)Fig. 2 Components (C1～C5) of soil humus by means of 3D EEM spectroscopy and PARAFAC

圖3 土壤腐殖質中各組分(C1～C5)的相對含量和峰積分Fig. 3 Relative percentages of the components (C1～C5) of the soil humus

應用主成分分析法進一步分析開墾與施肥對腐殖質組成的影響（圖4），結果顯示：未開墾草甸、不施肥和長期施肥油菜地（13 a與26 a）土壤的胡敏酸與富里酸樣品散點均各自團聚，且不同處理間散點相對分散。這可能進一步表明施肥與開墾使得土壤腐殖質組成發生了變化。其中，PC1與PC2分別解釋了不同處理下胡敏酸組分差異的66.9%和29.0%。沿PC1，導致樣品散點分散的主要因素是C1、C2、C3和C5組分在胡敏酸中相對含量上的差異，表明草甸土壤中胡敏酸中可能含有較多的類富里酸組分（C3與C5），開墾可能導致了這兩種組分相對含量的降低。沿PC2，導致其分散的主要因素則是C2和C4在胡敏酸中相對含量的差異。可能表明：長期施肥有利于類胡敏酸C2在土壤胡敏酸中相對含量的增加，但顯著降低水溶微生物副產物的相對含量（C4），這可能與施肥后作物殘體向土壤的輸入減少相關。對于富里酸，PC1與PC2分別解釋了不同處理下其組分差異的47.7%和45.6%。沿PC1，草甸土壤樣品散點與其他樣品散點分散開的主要原因是草甸土壤富里酸中含有較高的類富里酸組分C3和水溶微生物副產物C4，且含有較低的類胡敏酸組分C2，表明開墾可能消耗了富里酸中的類富里酸組分C3和水溶微生物副產物，但有利于生成類胡敏酸組分C2。沿PC2，開墾但不施肥的油菜地樣點與其他樣點相對分散，可能較低的營養狀況下導致了類富里酸組分C1的消耗。

圖4 土壤腐殖質組分(C1～C5)的主成分分析的散點圖與得分圖Fig. 4 Score-plots and loading sectors of the PCA of components (C1～C5) of soil humus

3 結 論

開墾與長期施肥顯著影響了黑鈣土的基本理化性質、土壤中胡敏酸與富里酸的光譜特性和土壤腐殖質中的分子組成，使土壤有機質含量降低的同時發生土壤酸化現象。開墾但不施肥處理使土壤中胡敏酸的腐殖化程度、相對分子量和芳香性均降低，而開墾后長期施肥則使胡敏酸的上述指標呈現相反的趨勢。富里酸在開墾后長期施肥的處理下，其相對分子量和芳香性均降低，而對內源依賴性提高。開墾后不施肥與開墾后長期施肥處理均使土壤中胡敏酸的大分子組分增多，小分子組分降低，并使土壤中富里酸的大分子組成數量和小分子組成數量均增加，且小分子組成的數量增加得更為顯著。綜上，青藏高原的農墾活動應當謹慎進行。對已開墾后的土壤應當長期施用有機肥以有效減緩有機質的降低。同時，由于施肥使得土壤富里酸對內源依賴性增強，建議在此基礎上擴展富里酸的來源。