紅景天提取物對缺氧誘導的肉雞肺動脈高壓綜合癥內皮素-1及其受體基因表達的影響

李 龍，劉鎖珠

(1.楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西藏農牧學院 動物科學學院，林芝 860000)

在肉雞育種中，由于育種人員過分重視提高體質量增長速度和飼料轉化率，忽略心肺生長的選育，造成現有肉仔雞品種心肺功能存在缺陷，肺動脈高壓和右心衰竭的發生率遠高于其他雞種[1-2]。缺氧環境會增加肉雞腹水癥的發生率，而營養手段是目前能夠有效預防肉雞腹水癥發生的主要措施。前期研究發現，飼料中添加紅景天水提物干粉(質量分數為 0.2%和 0.4%)能夠顯著降低缺氧條件下肉雞右心指數和腹水死亡率(已接受，待刊)，部分原因可能是紅景天能夠抑制轉錄因子 HIF-1α 的降解。HIF-1α 是機體應對缺氧的一種重要轉錄因子，其可以誘導EPO基因的表達增加從而提高動物體紅細胞數目[3]，同時 HIF-1α 還能夠影響內皮素基因的表達，從而改變動物機體在缺氧環境下的心血管機能[4]。內皮素在心血管疾病引起的心臟衰竭中起重要作用，其中內皮素-1(ET-1)既是機體維持正常生理狀態的生理調節因子，又是在某些病理狀態下產生和釋放的一種重要的致病因子[5]。 ET-1 是一個由 21 個氨基酸組成的具有血管收縮活性的多肽， ET-1受體有 ETA和 ETB2 種亞型，ETA在心肌中占主導地位[6]，血管中 ETA亞型主要在血管平滑肌細胞表達，而ETB受體在內皮細胞表達。刺激 ETA受體會引起收縮增殖和遷移，而刺激 ETB受體會引起具有擴增血管、降低血壓作用的一氧化氮(NO)釋放[7]。心臟中 ETA和 ETB是共存的，ET-1 發揮作用主要依靠 ETA和 ETB的調節[8]。Hassanpour等[9]研究發現在三碘甲狀腺原氨酸(T3)誘導的肉雞腹水癥模型中， ET-1 及其受體 ETAR 參與肉雞血壓的維持，在肉雞腹水癥的發病過程中起重要作用。但目前關于紅景天提取物是否能夠通過影響肉仔雞ET-1及其受體基因表達緩解缺氧條件下肉雞腹水癥發生的研究鮮見報道。因此，本試驗旨在研究不同紅景天提取物添加量對高原缺氧條件下肉雞血清內皮素水平、左右心室ET-1、ETAR和ETBRmRNA 表達水平的影響，為利用紅景天在高原缺氧條件下肉雞腹水癥的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

將 450 只 1 日齡 AA 雛雞(雄性)隨機分為 5個組，每組6個重復，每個重復 15 只雞。試驗所需肉雞均購自四川成都，出殼當日空運至西藏林芝西藏農牧學院教學實習基地(海拔 2 986 m)，進行為期 42 d 的飼養試驗。試驗過程中肉仔雞采用籠養，自由采食、飲水。試驗基礎日糧為肉雞商品全價配合飼料，其中，0～21 d 飼喂前期料(代謝能 12.7 MJ/kg；粗蛋白質量分數為 21.8%)，22～42 d飼喂后期料(代謝能13.2 MJ/kg；粗蛋白質量分數為20%)。5 個組分別在基礎日糧中添加質量分數為 0(對照組)、0.1%、0.15%、0.2%和 0.4%的紅景天水提物干粉。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 心臟指數測定 在第14、28 和 42天，每個重復隨機選取 1 只雞稱質量并頸部放血處死。解剖后取出心臟，剝離附著的脂肪與血塊，沿冠狀溝切除心房，稱總心室質量(Total ventricles mass, TV)，再沿縱溝分別剪下右心室(Right ventricles mass, RV)稱量，分別計算(右心指數RV/TV)和 RV/100g體質量 BW。肉雞右心指數大于 0.29 則判定肉雞發生肺動脈高壓綜合癥[10]。左右心室稱量后迅速放入液氮中凍存，備用。

1.2.2 RNA提取與熒光定量PCR 利用 RNA 提取試劑盒(全式金)提取左心和右心總 RNA，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。利用反轉錄試劑盒(全式金)將1 μg總 RNA 反轉錄為 cDNA，-20 ℃保存，備用。以GADPH 基因為內參基因進行定量分析，通過2-ΔΔCt方法計算ET-1、ETAR和ETBR的mRNA 表達量，利用 Primer Premier 5.0 軟件進行熒光定量引物設計，引物具體信息見表1。

表1 qRT-PCR檢測基因與引物Table 1 Primers used to analyze gene expression by quantitative PCR

1.2.3 血清內皮素水平檢測 在第14、28和42天，每個重復隨機選取 1 只雞翼靜脈采血，離心取上清，-20 ℃保存，備用。利用內皮素 ELISA 檢測試劑盒(Cayman)檢測血清中 ET-1 水平，操作嚴格按照試劑盒規定方法進行，每個樣品測定 3 次，取平均值。

1.3 統計分析

采用 SPSS 19.0 軟件的 one-way ANOVA對數據進行單因素方差分析，用Duncan’s 法進行多重比較，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 紅景天提取物對肉雞心臟指數和血清內皮素水平的影響

由表 2 可知，在 第14天， 各處理組之間的心臟指數和血清內皮素水平均無顯著差異(P>0.05)。相比于對照組，0.2%和0.4%紅景天組28 和 42 d血清 ET-1 水平及42 d的 RV/TV(右心指數)和 RV/BW(P<0.05)顯著降低 。在第28天和42天，0.2%和0.4%紅景天組肉雞血清內皮素水平顯著高于 0.1%和0.15% 紅景天組(P<0.05)，第42天RV/TV 和 RV/BW 顯著低于 0.1%和 0.15%紅景天組(P<0.05)。在整個飼養期，0.1%和 0.15%紅景天組與對照組在心臟指數和血清內皮素水平上均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 紅景天提取物對高原缺氧條件下肉雞左右心室 ET-1及其受體基因表達的影響

由表 3 可知，在第28天和第42天相比于對照組， 0.2%和 0.4%紅景天組肉雞左右心室中ET-1mRNA 表達量顯著降低(P<0.05)，右心室ETARmRNA 表達量顯著升高(P<0.05)。同時 0.2%和 0.4%紅景天組左右心室ET-1mRNA 表達量顯著低于0.1%和 0.15%紅景天組(P<0.05)，而右心室ETARmRNA 表達量顯著高于 0.1%和0.15%紅景天組(P<0.05)。0.1%和 0.15%紅景天組與對照組在第14、28 和42天ET-1、ETAR和ETBR3 個基因的表達量均無顯著差異(P>0.05)。

表2 肉雞心臟指數和血清內皮素水平Table 2 The cardiac indices and serum ET-1 level of broiler

注：同行數據不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:In the same row, values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).The same below.

表3 肉雞左右心室 ET-1及其受體mRNA表達Table 3 The mRNA level of endothelin-1 and its receptors in the left and right ventricles of broiler

3 討 論

右心肥大是肺動脈高壓的直觀生理表現，因此右心指數(RV/TV)被認為是判斷肉雞肺動脈高壓的最重要指標[11]。本研究發現，在西藏真實缺氧的環境中，第14 和 28天時對照組肉雞并未發生肉雞肺動脈高壓綜合癥(RV/TV小于 0.29)，但在第42天時肉雞出現明顯的肺動脈高壓綜合癥(RV/TV大于 0.29)，這主要是因為肉雞在 28 d 后體質量過大，而肉雞本身單位體質量代謝率(耗氧量)大約是其他哺乳動物的 2～2.5 倍[12]，造成肉雞后期需氧量過大，導致肺動脈高壓，形成右心肥大。

ET-1 是心血管系統產生的一種高效的血管收縮劑，已有大量研究表明 ET-1 系統紊亂是形成肺動脈高壓的重要機制。在人體上研究發現先天性肺動脈高壓患者血液中 ET-1 的水平顯著高于正常人群[13]，同樣在肉雞試驗中發現給肉雞飼喂 BQ123(ETAR 阻斷劑)顯著降低肉雞肺動脈高壓的發生率，提示 ET-1 在肉雞的肺動脈高壓發生中同樣發揮重要作用[14]。這些結果都說明 ET-1 水平與心肌損傷和心臟衰竭高度相關，而本研究發現在第42天 時， 0.2%和0.4%紅景天組血清中 ET-1 水平降低的同時右心指數顯著降低，肉雞肺動脈高壓緩解，進一步證實肉雞血液 ET-1 水平的升高是引起肺動脈高壓綜合癥的一個重要誘因。紅景天作為緩解缺氧的一種傳統藏藥，緩解高原缺氧損傷的一個重要機制是降低血液中 ET-1 的水平，這在體外[15]和體內[9]試驗中都得到證實，而本研究同樣發現在肉雞飼料中添加紅景天提取物能夠顯著降低血液 ET-1 水平。

本研究發現，肉雞左右心室都能表達ET-1基因，并且隨著飼養期的增加表達量不斷上升，這與前人的研究結果一致[16]。Hassanpour等[9]研究發現三碘甲狀腺原氨酸(T3)誘導的肉雞肺動脈高壓綜合癥模型下肉雞左右心室ET-1的表達量都會下降，而在哺乳動物模型(兔子、人)中的研究發現卻和肉雞肺動脈高壓情況下左右心室ET-1表達水平變化不同[16-17]，這可能是由于 ET-1 在鳥類和哺乳動物中的調節機制不同造成的。而本研究發現紅景天提取物能夠顯著降低第28天和第42天肉雞左右心室中ET-1mRNA的表達量，但這個結果還不足以說明血液中 ET-1 的水平降低與紅景天提取物降低左右心室ET-1mRNA 表達量有關，這主要是由于ET-1除左右心室以外的其他很多種類型的細胞都能夠分泌[15]。ETAR和ETBR對ET-1的功能具有重要的調節作用，本研究發現 0.2%和0.4%紅景天組顯著提高右心室ETARmRNA的表達量，但所有紅景天組對左心室ETAR和ETBRmRNA的表達量都無顯著影響，提示紅景天可能通過影響右心室 ETAR 的表達量來改善肉雞肺動脈高壓綜合癥。

本研究發現飼喂 0.2%和0.4%紅景天水提物干粉能夠顯著影響缺氧條件下肉雞血液ET-1水平、右心指數、ET-1及其受體 mRNA 表達量，但 0.1%和 0.15%紅景天組對測定指標均無顯著影響，提示紅景天提取物發揮作用存在計量依懶性，高于 0.2%才能夠發揮作用，這可能與紅景天水提物中活性成分有關。

4 結 論

本研究發現，飼喂0.2%和 0.4%紅景天水提物干粉能夠改善高原缺氧條件下肉雞肺動脈高壓綜合癥，這一作用與紅景天降低血液ET-1水平，降低左、右心室ET-1mRNA 表達水平和提高右心室ETARmRNA 表達水平有關。