牦犢牛源乳酸菌的篩選鑒定與體外益生特性評價

張學燕，聶召龍，王 通，潘 浩，孫 璐，王 磊，劉書杰，崔占鴻

(青海大學 畜牧獸醫科學院，青海省牦牛工程技術研究中心，青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，西寧 810016)

犢牛腹瀉病是青藏高原牦牛養殖中的常見疾病，嚴重影響犢牛的早期培育質量，主要是腸道病原菌和(或)病毒混合感染引起腸道正常菌群結構失衡所致。牦犢牛腹瀉最早發生在剛出生時期，發病期主要在2～5月齡，腹瀉率為17.57%，致死率為44.91%[1]。高睿等[2]研究表明，引起犢牛腹瀉的細菌性病原主要是致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等；同時，病原菌沙門氏菌和大腸桿菌的耐藥性表現也比較嚴重[3-4]。益生菌是一種能夠調節動物胃腸道微生物區系平衡，有利于動物健康發育和提高生產性能的微生物制劑，主要表現為提高動物對營養物質的消化吸收及利用，增強機體免疫功能和抵抗力，促進動物胃腸道生長發育[5-6]。乳酸菌作為一種重要的益生菌，在動物腸道定植生長良好，能產生大量有機酸類物質，可在腸道中形成一層菌膜，有效抵抗病毒和病原微生物的侵襲，增強對疾病的抵抗力[7]。乳酸菌及其代謝產物對沙門氏菌有較強的抑制作用[8]，且能有效抑制大腸桿菌[9]和金黃色葡萄球菌的生長[10]。但由于動物種類和生長環境的差異，益生乳酸菌定植于動物胃腸道的細菌種類和數量會有較大差異，且來自同源動物的菌種更有利于在動物體內定植。因此，因地制宜地分離篩選出牦犢牛源益生乳酸菌，對其腹瀉病預防和抗生素治療藥物替代研究非常重要，也具有很好的生產應用前景。

1 材料與方法

1.1 菌源樣品及培養基

菌源樣品來自青海省大通種牛場健康的3月齡牦犢牛6頭，屠宰后取胃腸道內容物洋浦冷藏保存，迅速帶回實驗室進行菌株分離試驗；指示菌株選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，由青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室提供。MRS液體培養基和MRS固體培養基參照文獻[11]配制；MH肉湯培養基配制：2 g牛肉粉，1.5 g可溶性淀粉，17.5 g酸水解酪蛋白，用去離子水定容至1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 抑病原菌乳酸菌的分離及純化

菌株分離純化：參照文獻[11]的方法進行；菌株保存：用滅菌的白色槍頭蘸取純菌株菌落，接種于液體MRS培養基中，37 ℃培養24 h，加甘油在-80 ℃下保存。

1.3 抗病原菌乳酸菌的篩選

①配制含瓊脂的液體MH肉湯培養基；② 1×105Pa滅菌20 min；③冷卻至50 ℃左右；④每20 mL MH肉湯培養基中加入新培養的指示菌20 μL(108CFU/mL)，混勻后倒入培養皿中冷卻；⑤用滅菌鑷子將牛津杯放入冷卻的固體MH肉湯培養皿中；⑥分別吸取200 μL純菌株培養液和MRS液體培養基加入到牛津杯，每個樣品3個重復；⑦4 ℃冰箱放置固定30 min；⑧37 ℃培養箱中培養24 h，篩選出能夠同時抑制3種指示病原菌的乳酸菌菌株，編號為XC3、DC8、DC1和A5。

1.4 乳酸菌的分子生物學鑒定

①取對數生長后期的純菌株2 mL；②常溫下，4 000 r/min離心10 min，獲得菌體；③用細菌基因組DNA提取試劑盒[Bacterial DNA Kit(50)D3350-01]提取細菌總DNA；④以1 μL純化的細菌總DNA為模板，用16S rRNA基因通用引物對菌株16S rRNA基因進行PCR擴增，擴增產物送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.5 乳酸菌的 16S rRNA基因序列分析

根據16S rRNA基因的測序結果，登錄NCBI網站，使用BLAST對比進行菌種的初步確定。結合GenBank中乳酸菌屬中其他菌種的16S rRNA基因序列，應用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.6 乳酸菌的生長曲線及pH變化

將篩選的乳酸菌菌株培養液按φ=1%接種于液體MRS培養基中，37 ℃培養箱培養48 h，從0 h開始每間隔2 h取出3個離心管(3個平行)，24 h后分別于30 h、36 h、48 h各取3個離心管，測定每管OD600nm的吸光光度值和pH。

1.7 乳酸菌的耐酸及耐膽鹽特性測定

用1 mol/L鹽酸對液體MRS培養基進行調整，使pH分別為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.4。在不同 pH的液體MRS培養基中按φ= 1%接入乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的培養液，37 ℃培養24 h，測OD600nm值。

在液體 MRS培養基中加入牛膽鹽，制成膽鹽質量濃度分別為0(對照)、1.5、3和6 g/L的MRS液體培養基。在不同膽鹽質量濃度的液體MRS培養基中按10 μL/mL接入乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的培養液，37 ℃培養24 h后，取100 μL進行平板菌落計數。

菌株存活率=a1/a0×100%；a1：處理組24 h 后每毫升活菌數(CFU/ mL)，a0：對照組24 h 后每毫升活菌數(CFU/ mL)。

1.8 乳酸菌人工胃腸液耐受性測定

配制A液：16.4 mLφ=9.5%～10.5%的HCl用蒸餾水稀釋至pH為3.0；配制B液：500 mL蒸餾水中加入6.8 g KH2PO4，溶解后用4 g/L 的NaOH溶液調pH至6.8，加水稀釋至1 000 mL。配制人工胃液：100 mL A溶液中加入1.0 g胃蛋白酶，充分溶解并混勻后用0.2 μm無菌濾膜過濾。配制人工腸液：用100 mL B液體中加入1.0 g胰蛋白酶，充分溶解并混勻后用0.2 μm無菌濾膜過濾。在人工胃液和腸液中按10 μL/mL接入乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的培養液，37 ℃ 140 r/min搖床培養，分別在0、0.5和3 h取樣進行平板菌落計數。

1.9 數據處理與分析

所有試驗數據先采用Excel 2016進行初步分析，再用SPSS 20.0軟件進行方差分析，采用Duncan’s法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 抑病原菌乳酸菌的分離篩選

在相同濃度指示菌條件下，從牦犢牛胃腸道內容物中共篩選出XC3、DC8、DC1和A5 4株同時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有良好抑制作用的菌株(圖1)。

2.2 乳酸菌的 16S rRNA基因序列分析

通過對菌株XC3、DC8、DC1和A5的16S rRNA基因測序，對測得的序列進行Blast比對，結果發現菌株XC3與乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticistrain L169(登錄號：GU904688.1))相似性為100%；菌株DC8與羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteristrain VB4(登錄號：JQ073738.1))相似性為99%；菌株DC1與戊糖片球菌(P.pentosaceusstrain F1S2(登錄號：KF245540.1))相似性為100%；菌株A5與植物乳桿菌(L.plantarumstrain KC28(登錄號：CP026743.1))相似性為100%。將菌株XC3、DC8、DC1和A5的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中部分乳酸菌的16S rRNA基因序列進行同源性比較，應用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-joining法構建系統發育樹(圖2)。結果顯示，菌株XC3與乳酸片球菌(P.acidilactici)親緣關系最近，其次是棒狀皮炎球菌(P.lolii)；菌株DC8與羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)親緣關系最近；菌株DC1與戊糖片球菌(P.pentosaceus)親緣關系最近；菌株A5與乳桿菌(L.plantarumL. brevis)親緣關系最近。初步確定菌株XC3為乳酸片球菌，DC8為羅伊氏乳桿菌，DC1為戊糖片球菌，A5為植物乳桿菌。

圖1 乳酸菌的抑菌圈直徑Fig.1 Determination of bacteriostasis circle diameter of lactic acid bacteria

圖2 依據 16S rRNA 基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequences

2.3 乳酸菌的生長曲線及pH變化

在一定范圍內，菌株懸浮液中細胞濃度與吸光度呈正相關，因此，一定波長下菌株懸浮液的濃度可用光密度反應。從菌種生長曲線圖可以看出(圖3)，4株乳酸菌的延遲期比較短，在培養2 h后進入對數生長期，乳酸菌DC1、DC8和A5培養6 h后，生長速率下降，乳酸菌XC3培養8 h后，生長速率下降，但是菌株依舊生長緩慢，培養12 h后菌株進入穩定期，培養48 h后菌株未進入衰退期。菌株生長速率與菌株培養液的pH變化規律相一致(圖4)，即乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在2～12 h快速生長，培養液的pH迅速下降，12 h后pH基本穩定。

2.4 4株乳酸菌的耐酸和耐膽鹽特性

從圖5可以看出，隨著pH的下降，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的活菌數均不同程度降低，pH=3時，4株乳酸菌的活菌數較高；pH=2時，4株乳酸菌的生長受到嚴重影響，活菌數明顯下降，說明4株乳酸菌對pH=2的酸性環境表現出高度敏感。

由表1可以看出，牛膽鹽對乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的生長有抑制作用。隨著膽鹽質量濃度的增加，對4株乳酸菌的抑制作用也逐漸增強。牛膽鹽質量濃度對不同乳酸菌菌株的生長具有不同的抑制作用。乳酸菌菌株在1.5 g/L的牛膽鹽培養液中培養24 h后，菌株XC3的耐受性最強，存活率達到98.46%，菌株DC8、A5和DC1的存活率分別為87.30%、86.72%和51.88%；乳酸菌菌株在3 g/L的牛膽鹽培養液中培養24 h后，菌株XC3的存活率為93.85%，菌株DC8和A5的存活率降為51.59%和51.18%，菌株DC1受到較強抑制作用，存活率僅為6.77%；培養液中膽鹽質量濃度為6 g/L時，4株乳酸菌菌株的生長均受到極強抑制，存活率均低于10%。

圖3 4株乳酸菌的生長曲線圖Fig.3 The growth curve of four lactic acid bacteria

圖4 4株篩選乳酸菌培養液的pH變化Fig.4 Changes of pH in culture medium of four lactic acid bacteria

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters represent significant difference(P<0.05)

表1 4株乳酸菌在不同膽鹽質量濃度培養液中培養24 h后的活菌數及存活率Table 1 The viable counts of four lactic acid bacteria in bile salt with different mass concentration after 24 h

2.5 乳酸菌對人工胃液和腸液的耐受性

由表2和表3可以看出，與0 h(對照組)相比較，4種乳酸菌生長均受胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制，處理0.5 和3 h后活菌數均有所下降。但是4種乳酸菌菌株對人工胃液、腸液有一定的耐受性，人工胃液處理0.5 和3 h后，4株乳酸菌的存活率均高于80%，經人工腸液處理0.5 和3 h，存活率均高于70%。

表2 人工胃液處理下4株乳酸菌的活菌數及存活率Table 2 Effect of artificial gastric juice on survivability and survival rate of four lactic acid bacteria

表3 人工腸液處理下4株乳酸菌的活菌數及存活率Table 3 Effect of artificial intestinal juice on survivability and survival rate of Lactic acid bacteria

3 討 論

細菌性腹瀉是新生犢牛的一種常發性疾病，犢牛一旦感染，生長發育受到一定程度的影響，生產性能降低，造成不可忽視的經濟損失。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌是引起動物細菌性腹瀉的主要病原菌[12]。乳酸菌及其代謝產物產生的酸性內環境，對大腸桿菌和沙門氏菌的生長與繁殖表現出不同程度的抑制作用[13-14]。本研究將篩選菌源定位于同種動物(牦犢牛的胃腸道內容物)，通過抗病原菌特性篩選出能夠同時抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的乳酸菌，從而得到適合應用于牦犢牛生產的微生物添加劑菌種。通過16S rRNA基因序列分析與鑒定表明菌株XC3為乳酸片球菌，菌株DC8為羅伊氏乳桿菌，菌株DC1為戊糖片球菌，菌株A5為植物乳桿菌。

微生物在生長過程中，總共經歷4個時間段，分別為適應期、對數期、穩定期和衰亡期。測定菌株的生長曲線對于確定合適的培養時間具有重要作用，常將微生物對數中后期和穩定期的菌液作為微生物制劑研究對象。本研究中觀察乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的生長曲線發現，4株乳酸菌在液體MRS培養基中培養12 h后進入穩定時期，細菌數較高，穩定性較好，是生產上用于接種的最適合菌齡。發酵液 pH可直觀地反映菌株的產酸能力，隨著培養時間的增加，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5培養液的pH均不同程度下降，培養12 h后菌液的pH下降速度減慢，基本趨于穩定狀態，適合應用于微生物制劑的制備。

目前已有關于體外法篩選益生菌的相關報道[15]。益生菌對瘤胃和腸道內環境的較高耐受性是篩選優良益生菌的重要指標之一[16-17]。乳酸菌pH和膽鹽質量濃度的耐受性提高了乳酸菌進入動物腸道的定植能力[18]。酸耐受性是檢測乳酸菌益生作用的重要指標，乳酸菌只有耐受胃液的低pH環境，才可能在胃腸道環境中定植，發揮其益生功能[19]。本研究結果表明，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在pH=2的環境中受到嚴重影響，活菌數迅速降低，在pH=3的環境，菌株的活菌數較高，說明乳酸菌對低酸的胃內環境有抵御力。膽鹽耐受性是檢測乳酸菌能否在胃腸道定植，并在腸道發揮益生作用的關鍵指標[20]。膽鹽會使膜蛋白解離，細胞內容物滲漏，導致細胞死亡[21]。乳酸菌需要耐受3 g/L膽鹽的腸道內環境才能在腸道中定植[22]。本研究中，膽鹽質量濃度為3 g/L時，乳酸菌XC3生長狀況良好，乳酸菌DC8和A5的生長受到一定影響，但存活率在50% 以上，說明乳酸菌 XC3、DC8和A5能夠耐受腸道內膽鹽形成的高滲透壓環境。乳酸菌DC1在膽鹽質量濃度為3 g/L的環境中生長受到嚴重影響，存活率僅有6.77%，說明乳酸菌DC1對腸道內的膽鹽環境抵御力弱。

胃液中的胃蛋白酶等抗菌物質是抵御乳酸菌進入腸道的第一道天然屏障。本研究利用人工胃液檢測各菌株的生長情況，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在人工胃液中生長3 h 存活率均大于80%，由此推測乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5作為益生菌對胃內酸性環境具有較強抵抗力，大部分都可以在胃內存活。同時，益生乳酸菌若要在動物腸道存活及增殖，需要能夠耐受膽鹽和胰液對菌體的破壞作用[23]。模擬人工腸液試驗結果表明，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在人工腸液中生長3 h存活率均大于70%，說明乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5作為益生菌對腸道內環境有較強抵抗力，能夠在腸道中成功定植并生長。

4 結 論

以牦犢牛的胃腸道內容物為菌源，分離篩選出對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌3種致病菌具有較強抑制作用的乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5，經16S rRNA基因序列分析鑒定，確定XC3為乳酸片球菌，DC8為羅伊乳桿菌，DC1為戊糖片球菌，A5為植物乳桿菌；通過對篩選乳酸菌的耐酸、耐膽鹽，人工胃液和腸液耐受性等體外益生特性研究，確定XC3、DC1和A5具有潛在的益生作用，能作為牦犢牛益生菌制劑的添加對象。